氨基糖苷類抗生素的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

鐘艾玲 田敏,* 劉艷全 易欣 龍燕 雷葉明 王富強(qiáng)

(1 抗生素研究與再評價四川省重點(diǎn)試驗(yàn)室，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都大學(xué)，成都 610052；2 微生物藥物生物合成技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，成都雅途生物技術(shù)有限公司，成都 610041)

氨基糖苷類抗生素(AGs)是對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抗菌活性的高效廣譜抗生素。自1944年發(fā)現(xiàn)鏈霉素后，大量氨基糖苷類抗生素相繼被發(fā)現(xiàn)，并開發(fā)了阿米卡星、奈替米星等半合成衍生物[1]。氨基糖苷類抗生素是由兩個或多個與氨基環(huán)醇核心連接的氨基修飾的糖組成，大部分AGs含有2-脫氧鏈霉胺(2-DOS) 核心，如慶大霉素、妥布霉素等。鏈霉素及其衍生物雙氫鏈霉素則不含2-DOS[2-3]。氨基糖苷類抗生素雖然具有耳毒性和腎毒性[4]，但它們?nèi)允侵委煾锾m陰性菌感染的重要藥物，在臨床應(yīng)用中被廣泛使用。

細(xì)菌對抗生素耐藥性可分為3大類：固有耐藥，自適應(yīng)耐藥和獲得性耐藥。抗生素的固有耐藥性如細(xì)菌細(xì)胞壁自然的低滲透性，能限制許多抗生素的攝取；抗生素的自適應(yīng)耐藥是由于環(huán)境改變(如營養(yǎng)濃度變化)引起抗生素的耐藥基因或蛋白質(zhì)表達(dá)水平改變；通過摻入外源遺傳物質(zhì)，通常是攜帶多個抗性基因的質(zhì)粒，或通過現(xiàn)有基因的突變，可以獲得抗生素耐藥性[5-7]。

多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響抗生素對感染性疾病治療的成功率，了解AGs的耐藥機(jī)制對耐藥細(xì)菌感染性疾病的治療以及新型AG藥物的開發(fā)具有重大意義[8]。本文集中闡述AGs耐藥機(jī)制方面的研究進(jìn)展。

1 核糖體修飾

1.1 核糖體突變

細(xì)菌核糖體由5S rRNA和23S rRNA及多種蛋白質(zhì)組成的大亞基(50S)和小亞基(30S)組成。蛋白質(zhì)翻譯的步驟發(fā)生在核糖體的3個位點(diǎn)，E-、P-和A-位點(diǎn)。AGs與A位點(diǎn)結(jié)合，位于細(xì)菌小亞基的16S RNA上[9-10]。最近晶體結(jié)構(gòu)解析闡明AGs與大腸埃希菌16S RNA中高度保守的核苷酸堿基H44螺旋之間的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯錯誤。一些含有2-DOS的AGs，如新霉素B(NEO)、慶大霉素(GEN)和巴龍霉素(PAR) 還可以結(jié)合到23S RNA的H69螺旋上(圖1)，干擾了翻譯和核糖體回收[11]。

細(xì)菌通過16S rRNA編碼基因rrs突變，阻礙AG的結(jié)合，產(chǎn)生AG抗性[12]。如rrs基因A1408G的突變，破壞含有2-DOS的AGs和核苷酸A1048間的氫鍵作用產(chǎn)生AG抗性。在臨床分離的耐藥結(jié)核分枝桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A1401G、C1402T和G1484T 3個rrs基因突變位點(diǎn)[13-14]。除此之外，編碼S12蛋白的基因突變也可提高結(jié)核分枝桿菌的抗鏈霉素活性。

1.2 甲基化酶修飾核糖體

除了突變之外，AG結(jié)合位點(diǎn)可以通過16S核糖體RNA甲基化酶(Rmt酶) 進(jìn)行酶促修飾。放線菌產(chǎn)生Rmt酶，通過對自身16S RNA甲基化來保護(hù)核糖體免受自身產(chǎn)生的AG的抑制。

圖1 新霉素在核糖體小亞基(H44)和大亞基(H69)上的結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 Neomycin-binding sites in the small-subunit decoding site (H44) and in the large-subunit (H69)

Rmt酶分為兩類：1)外源性Rmt酶：主要通過修飾核苷酸G1405(RmtA,RmtB,RmtC,RmtD1,RmtD2,RmtE，RmtF,RmtG,RmtH)的N7位甲基化基因和在A1408的N1位甲基化的基因(NPMA)產(chǎn)生AG抗性[15]。 N7-G1405 Rmt酶通過修飾核糖體使細(xì)菌對4,6-二取代的2-DOS AG，如阿米卡星(AMK)、慶大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)和卡那霉素A(KANA)等抗生素具有耐藥。N1-A1408 Rmt酶通過修飾核糖體是細(xì)菌對4,5-和4,6-二取代的含有2-DOS的AGs和對安普霉素(APR)產(chǎn)生pan-AG抗性(pan-aminoglycosideresistance)[15]。2)內(nèi)源性Rmt酶：其三維結(jié)構(gòu)與外源性Rmt酶相似。研究表明，內(nèi)源性核糖體甲基化酶(如RsmH和RsmI)與外源性Rmt酶能共存，內(nèi)源性甲基化酶在大腸埃希菌中使C1402位甲基化，修飾30s核糖體亞基[17]，當(dāng)外源性Rmt酶存在時會阻礙C1402位甲基化作用，影響大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有RsmF酶的菌體具有更高的抗生素抗性，這也證實(shí)了內(nèi)源性RsmF酶能夠影響細(xì)菌對AGs的敏感性[18]。

Rmt酶之間的結(jié)構(gòu)相似性有助于開發(fā)多個靶向Rmt酶的抑制劑。因此，設(shè)計(jì)小分子抑制劑以克服Rmt酶的修飾作用，對于減緩AGs耐藥性的研究至關(guān)重要。

2 AG修飾酶

氨基糖苷修飾酶(AMEs)的化學(xué)修飾作用是細(xì)菌產(chǎn)生AG耐藥的最廣泛的的途徑。根據(jù)AMEs對AGs的化學(xué)修飾作用，將其分為3個亞類[19]：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(AACs)，O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶(ANTs)和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APHs)。AACs主要催化底物的乙酰化作用，根據(jù)它們對AG修飾部位的不同又分為4種酶：AAC(1)、AAC(3)、AAC(2′)和AAC(6′)。APHs對氨基糖苷分子上的磷酸鹽基團(tuán)進(jìn)行催化，分為APH(2′)、APH(3′)、APH(3′)、APH(4)、APH(6)、APH(7′)和APH(9)。ANTs修飾依賴于ATP的腺苷化，根據(jù)它們在底物氨基糖苷2′、3′、4′、6′和9位的化學(xué)修飾的區(qū)域，其可分為五種酶：ANT(2)、ANT(3)、ANT(4)、ANT(6)和ANT(9)[20]。

每個AME在一個特定的位置修飾一個AG。此外，在臨床耐AG的菌株中發(fā)現(xiàn)一種雙功能酶，該酶的結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)使得乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性域可以修飾6′-NH2，還可以修飾6′-OH，磷酸轉(zhuǎn)移酶雖然只能修飾羥基，但其修飾位置有多個，所以它的活性不受AGs的影響。如利維霉素中缺乏6′-NH2，在雙功能酶存在時，細(xì)菌可以修飾6′-OH位點(diǎn)而被乙酰化[21]。AMEs基因大多位于可移動元件上，常與其他抗性基因(如Rmt酶或β-內(nèi)酰胺酶) 一起轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座元件上，在致病菌中傳播能力極強(qiáng)，大部分致病菌通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得抗性AMEs耐藥基因[22]。

近年來，AME引起的耐藥性的研究逐漸深入，對抗菌藥物的應(yīng)用及研發(fā)新型藥物有著極重要的意義。由于AME的協(xié)同組合作用，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多種AG抗性，目前新設(shè)計(jì)的抗菌劑有硫醚、烷基化和酰化的AG變體和異形二聚體、及側(cè)鏈含有AHB(fluorinated (S)-4-amino-2-hydroxybutyrate)的NEO類似物等抗生素，它們能夠逃避多種AME的作用。同時研究表明了金屬陽離子可以抑制AAC活性，從而提高AGs對耐藥菌株的作用[23-25]。

3 細(xì)胞膜的修飾

AG作用于細(xì)菌時，必須穿過細(xì)菌的細(xì)胞壁。革蘭陰性菌的細(xì)胞壁由內(nèi)膜、肽聚糖層、磷脂雙層和外膜(OM)組成。分枝桿菌有一個獨(dú)特的細(xì)胞外殼，由內(nèi)膜組成，接著是一層肽聚糖層，與一層阿拉伯半乳聚糖相連，并與高分子量分枝菌酸相連，并被外層單層磷脂覆蓋。這些多層細(xì)胞壁充當(dāng)屏障，為革蘭陰性菌和分枝桿菌提供了對AG耐藥性的先天機(jī)制，細(xì)胞壁組合物的修飾可能導(dǎo)致對AG的滲透性更差[26]。

OM作為內(nèi)在的第一道防線，保護(hù)諸如AG等外來分子對革蘭陰性菌作用。OM向外的部分由帶凈負(fù)電荷的脂多糖(LPS)組成，能吸引陽離子AGs。LPS的修飾作用等摻入帶正電荷的阿拉伯糖，有效的減少LPS層的凈負(fù)電荷，降低對AGs的親和力[27-28]。

孔蛋白通道含有大量的水，允許親水小分子的被動擴(kuò)散。雖然已經(jīng)研究了β-內(nèi)酰胺抗生素通過孔蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，但在革蘭陰性細(xì)菌中的通過孔蛋白的AGs轉(zhuǎn)運(yùn)尚不清楚[29-30]。盡管目前還沒有關(guān)于由孔蛋白變化引起的臨床AG抗性的記錄病例的報道，但是孔蛋白表達(dá)變化可能產(chǎn)生較低的抗性機(jī)制，因?yàn)樗鼈円部赡軐?dǎo)致細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取減少而增加藥物的MIC[30]。

4 外排泵

細(xì)菌另一個抗AG的機(jī)制是通過主動外排系統(tǒng)的過量表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌對AGs耐藥增強(qiáng)。但由于AGs的聚陽離子結(jié)構(gòu)，只有少數(shù)泵被證明可以轉(zhuǎn)運(yùn)出AGs。其中，革蘭陰性菌的主要AG外排泵AcrAD是多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是RND(resistance nodulation cell division)家族的一員，細(xì)菌通過Acr AD蛋白，能夠起到藥物-質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。該家族還有MexXYOprM系統(tǒng)等外排系統(tǒng)[30]。

雖然外排泵對細(xì)菌產(chǎn)生AG耐藥性的影響很低。但是慢性銅綠假單胞菌感染的囊纖維化患者的分離物中，阻遏基因mex Z的突變導(dǎo)致的MexXY過表達(dá)，從而產(chǎn)生AG耐藥性。有研究已經(jīng)證明了AGs，紅霉素、四環(huán)素和甘氨酰環(huán)素可以誘導(dǎo)Mex XY的表達(dá)[31-32]。

通過外排泵對AG耐藥產(chǎn)生的機(jī)制設(shè)計(jì)抗生素來逃避或者阻斷外排泵的作用已經(jīng)成為開發(fā)新型抗生素的方向。

5 其他耐藥機(jī)制

AGs的作用之一是合成異常蛋白質(zhì)，擾亂細(xì)胞膜的完整性。膜蛋白酶是蛋白質(zhì)生物合成質(zhì)量控制的內(nèi)在系統(tǒng)的一部分，可識別和降解錯誤折疊和翻譯的蛋白質(zhì)。雖然傳統(tǒng)上不被認(rèn)為是抗性機(jī)制，膜蛋白酶可以在一定程度上降低AGs的耐受性，從而提高耐藥性。銅綠假單胞菌中的膜蛋白酶(Fts H)的突變導(dǎo)致細(xì)菌對妥布霉素(TOB)的敏感性增加，這表明FtsH在AG抗性中發(fā)揮作用[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)銅綠假單胞菌暴露于TOB時，導(dǎo)致編碼Lon型蛋白酶的asrA的表達(dá)以及熱休克基因的表達(dá)增加，細(xì)菌產(chǎn)生抗生素的適應(yīng)性耐藥[34]。銅綠假單胞菌對AG的適應(yīng)性耐藥與其產(chǎn)生的生物膜有關(guān)[35]，生物膜將細(xì)菌包圍，從而降低AG的作用。

6 結(jié)論

以上討論的耐藥機(jī)制對AGs的耐藥作用程度不同，且作用范圍也不同。如AME通常只有對少數(shù)的AG底物(如GEN、TOB或AMK)起作用，而RMTases對許多的AG底物起作用。最具有威脅性的細(xì)菌種類具有多種抗性機(jī)制，其多種抗性機(jī)制的影響是相加的。例如，外膜作為限制AG攝取屏障的內(nèi)在性質(zhì)可以與其他抗性機(jī)制協(xié)同作用，導(dǎo)致細(xì)菌高度的AG耐藥性。

目前，逃避細(xì)菌的AG抗性機(jī)制來設(shè)計(jì)藥物是開發(fā)新藥物的主要方向。20世紀(jì)70年代設(shè)計(jì)了許多半合成衍生物，包括阿貝卡星(ABK)、異帕米星(ISP) 等。雖然ABK和ISP仍然易受RMT酶和AME修飾，但是有時候不會被AAC修飾[36]，從而有效的降低耐藥性。Plazomicin(PLZ)是西索米星(SIS)的衍生物，已經(jīng)有研究顯示其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和碳青霉烯耐藥的腸桿菌(CRE)是有效的，它可以克服許多AME的作用，是目前抵抗抗生素耐藥性的重要武器[37]。

耐藥性是一個重大的臨床和公共衛(wèi)生問題，一些醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)獲得性病原體已經(jīng)對不同的抗生素產(chǎn)生了抗藥性，使治療更加復(fù)雜化。隨著對AGs耐藥機(jī)制的深入了解，設(shè)計(jì)能克服這些抗性機(jī)制的新型氨基糖苷類藥物，將降低細(xì)菌耐藥造成的全球健康危機(jī)的影響。