野野村放線菌ATCC 39727的雙組份信號轉導系統的生物信息學分析

岳雪 王帥 李大成 王勇健 董惠鈞,*

(1 聊城大學藥學院，聊城 252000；2 聊城大學生物制藥研究院，聊城 252000)

野野村放線菌(Nonomuraeasp.ATCC39727)可以產生糖肽類抗生素達巴萬星前體A40926，經酯化、酰胺化、水解和成鹽等步驟合成達巴萬星。達巴萬星主要用于治療革蘭陽性菌引起的皮膚和皮膚組織感染，抗菌活性優于同類藥物萬古霉素和替考拉寧[1]。野野村放線菌基因組已測序完成，大小約11.85Mb，基因組上分布有33個次級代謝生物合成基因簇。糖肽抗生素達巴萬星前體A40926的合成基因簇dbv包含37個開發閱讀框(open read frame,ORF)，大小為71kb，指導氨基酸前體物先合成七肽骨架，經環化和后修飾生成A40926[2]。

相對于高等動植物，微生物有著超強的環境適應能力。微生物這種超強能力的遺傳基礎是其擁有復雜多樣的信號轉導系統，其中最重要的信號轉導系統是雙組分信號轉導系統(two-component signal transduction system,TCS)。TCS目前只在細菌、古生菌和植物中有發現，而在人類和其他哺乳動物體內尚未發現。通常TCS系統由組氨酸激酶(histidine kinase,HK)和應答調節蛋白(response regulator,RR)構成。HK中含有重復序列的N端胞外感受域和保守的C端胞內傳導域(HisKA)，由N端胞外感受域感應外界的特定環境刺激信號。RR通常包括一個保守的N端接受域和一個多變的C端輸出域(REC)組成，通過天冬氨酸殘基調控細胞內的一系列應答反應[3]。大多數細菌體內都存在數量不等的TCS，它們調控細菌的趨化性、感知滲透壓、pH、金屬離子、形態分化、營養物質代謝以及次級代謝產物的生物合成等諸多生理過程。

放線菌具有復雜的次級代謝產物和網絡。與之相對應，放線菌中也具有豐富多樣的TCS系統，兩者之間息息相關。本文通過生物信息學方法對Nonomuraeasp.ATCC39727中TCS的分類、保守結構域、進化關系以及功能進行分析，旨在深入解析ATCC39727的生長和代謝相關基因的表達和調控，為進一步解析A40926合成代謝和調控，構建高產工程菌株提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 ATCC39727基因組中雙組份信號系統預測和結構功能分析

根據雙組份信號系統HK和RR蛋白保守結構域分析ATCC39727基因組中可能存在的雙組份系統。本文中ATCC39727基因組序列信息來自NCBI數據庫。ATCC39727雙組份信號系統的鑒定方法：(1)利用 Pfam 數據庫中保守的HK和RR結構域HATPase_c(Pfam00512)和Response_reg(Pfam00072)對ATCC39727基因組進行搜索比對，分別鑒定基因組中的HK和RR；(2)用NCBI的Blast P對得到的HK/RR序列進行在線比對。

雙組份信號系統的確認標準：(1)HATPase結構域應該位于HK蛋白的C端；(2)HisKA位于HATPase 結構域的前面，HATPase_c的上游具有二聚化或磷酸化結構域DHp；(3)RR的N端含有磷酸受體，Response_reg結構域位于RRs的C-末端。最后，參照 Williams和Whitworth的方法[4]對成對的TCS(HK-RR對)、融合HK和孤兒HK/RR進行鑒定。如果HK和RR 位于同一操縱子上，則該HK和RR成功配對為成對 TCS；如果HisKA和REC結構域同時出現在一個蛋白上，那么該蛋白定義為融合HK；如果HK/RR在同一操縱子上找不到對應的RR/HK，則該HK/RR定義為孤兒HK/RR。

1.2 雙組份信號進化樹和調控網絡構建

分別將ATCC39727基因組中所有HK和RR蛋白序列導入Mega 6.0軟件中，首先進行Clustal W同源比對，然后選用NJ法構建進化樹，并進行Boot-strap驗證，重復次數設置為1000。

利用Pfam、SMART和BLASTp進行保守結構域分析，并用UniprotKB數據庫進行輔助驗證，結合文獻報道，預測TCS各組分的功能，并在此基礎上構建ATCC39727 TCS信號轉導網絡。

2 結果與分析

2.1 ATCC39727基因組中TCS分布

與其他微生物相比，放線菌具有復雜的形態分化和豐富的次級代謝網絡。與之相對應，放線菌也含有豐富的TCS系統，與大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌平均25個成對TCS相比，天藍色鏈霉菌和野野村放線菌則分別含有67對和60對TCS(表1)。進一步對比發現，野野村放線菌TCS系統中的HK和RR蛋白更加保守，幾乎沒有特異性結構域。通過搜索比對和分析發現，ATCC39727基因組中含有豐富的TCS基因，共有213個相關編碼基因。進一步分析其中112個基因編碼HK蛋白，包含60個TCS HK-RR和52個孤兒HK，99個基因編碼TCS RR蛋白，包含60個HK-RR和39個孤兒RR，另外還有2個融合HK(表2)。盡管在細菌基因組中TCS基因所占比例不大(通常低于5%)，但在調控微生物生理生化代謝中發揮重要作用。

表1 幾種模式微生物TCS系統比較Tab.1 Comparison of TCSs from different model microorganisms

2.2 ATCC39727基因組HKs蛋白分類

從ATCC39727基因組中搜索到所有可能的HK蛋白后，用Pfam、SMART和NCBI進行蛋白結構域分析。TCS的HK蛋白通常為跨膜蛋白，包含胞外信號感應域(sensing domain)、胞內信號傳遞域(transmitter domain)和ATP酶域(ATPase domain)[5]。根據結構域的組成情況，ATCC39727中112個HK蛋白分為14組，其中65個HK蛋白含有多個重復序列和HATPase_c結構域，35個HK蛋白含有HAMP、HisKA和HATPase_c3個結構域，其余12個HK蛋白含有各異的結構域組合，感應結構域主要有HAMP、GAF和PAS(圖1)。HATPase_c結構域是胞內負責將ATP的磷酸基團轉移到組氨酸上的催化結構域，HisKA則是接受磷酸的受體結構域，HAMP結構域是受體組氨酸激酶和甲基接受蛋白的細胞質螺旋連接結構域，PAS結構域與感應外界氧、氧化還原電位和光的變化有關，GAF結構域主要對環核苷酸結合發揮作用，例如cGMP和cAMP等。

表2 Nonomuraea sp.ATCC39727基因組中雙組份系統Tab.2 Two-component signal transduction systems in Nonomuraea sp.ATCC39727

續表2

根據結構域功能可將HK蛋白分為胞質感應HK、胞外感應HK和膜感應HK。含有PAS和GAF結構域的HK為胞質感應HK，含有跨膜和HAMP結構域的HK為胞外感應HK，僅含有跨膜結構域和HATPase_c的為膜感應HK。從圖1可以看出，ATCC39727中的HK蛋白絕大多數是胞外感應和膜感應類型。

為了解ATCC39727基因組中TCS基因的相互關系，分別對ATCC39727菌株中所有的HK和RR蛋白序列進行比對和進化分析，發現行使不同功能的HK蛋白之間的序列保守性弱，呈現多樣性，而RR蛋白的保守性則要強一些。另外從HK-RR來比較，同源相近的HKs對應的RRs并不同源，反映了TCS進化的多樣性(圖2)。

2.3 ATCC39727基因組RRs蛋白分類

與HK相比，RR在長度和組成上都相對保守，它由N端含有Asp殘基的高度保守的信號接受域(receiver domain)以及C端的效應結構域(effector domain)兩部分組成。根據結構域的差異，ATCC39727中的RR蛋白可以分為6類(圖3)。其中含有REC和HTH_LUXR結構域的RR蛋白最多，共有57個；其次有24個RR蛋白含有REC和Trans reg_c結構域；RR蛋白中最多的結構域是REC結構域(趨化蛋白CheY同源的受體結構域)，ANTAR結構域是RNA結合輸出域，HTH_LUXR 結構域起到結合DNA和轉錄激活的作用。

圖1 TCS HKs蛋白結構域類型Fig.1 Conserved domain compositionof TCS HK proteins

2.4 ATCC39727 TCS功能預測

根據ATCC39727基因組中HKs和RRs蛋白的保守結構域和相對位置，發現了60對不同的TCS。根據Blast P結果注釋和相關文獻，對60對TCS的功能進行了預測和分析(表3)。結果表明，ATCC39727中的TCS同其他微生物中的功能類似，主要包括細胞壁和細胞膜的合成和調節，例如VraS/VraR(調節肽聚糖合成)、LiaS/LiaR(與細胞壁壓力和抗菌肽調節相關)、MtrA/MtrB(調節滲透壓)、DesR/DesK(調節細胞膜流動性)；調節細胞形態分化，例如BaeS/BaeR(調節DNA起始復制)、ArlS/ArlR(調控接合和自溶)、DevR/DevS(啟動細胞休眠)、DegS/DegU(調控生物膜形成)、PrrB/PrrA(調控細胞早期增殖)、YdfH/YdfI(參與細胞分化)；參與營養元素代謝，例如NarS/NarL(參與硝酸鹽代謝)、PhoP/PhoR(參與磷代謝)、NreB/NreC(參與硝酸鹽異化和亞硝酸鹽代謝)、NarX/NarP(調節氮代謝)；調節重金屬離子平衡和抗性，例如CzcS/CzcR(調節Zn代謝)、CopS/CopR(與銅抗性基因有關)、CutS/CutR(調節銅代謝)、IrlR/IrlS(與重金屬抗性有關)、PcoS/PcoR(活化銅抗性基因)、TcrY/TcrX(與鐵缺乏有關)；與細胞抗性和毒力相關，例如YvfT/YvfU(與細菌毒力有關)；調節細胞呼吸和途徑代謝，例如ResD/ResE(調控有氧和無氧呼吸)、MprB/MprA(全局調控子)、UhpC/UhpB(調控己糖磷酸化)。

2.5 ATCC39727中TCS調控網絡

通過對ATCC39727基因組中的TCS進行功能預測，并結合相關文獻，構建了ATCC39727中部分TCS調控網絡。TCS調控網絡的顯著特征是相互交叉，呈現“一對多或多對一”的級聯反應(圖4)。例如在缺氧情況下，ResD誘導YclJK雙組份表達，進一步YclJK正調控YsfCD表達，后者又同時被DesSU負調控。又例如在磷酸鹽缺乏時，PhoR/PhoP系統激活，誘導另一組磷代謝相關的雙組份系統PhoA/PhoB，同時會抑制氮代謝相關蛋白GlnA的表達，而GlnA會通過TnRA蛋白與DegS/DegU相互作用。在ATCC39727中存在多個與金屬離子代謝相關的TCS。CopS/CopR在環境中銅離子的壓力下激活，進而誘導結構基因copABCD表達，copABCD的表達會進一步激活PcoS/PcoR，Pco相關蛋白的表達外排銅離子、抵抗銅離子的毒害。類似的，鋅離子的存在會激活CzcS/CzcR，進而誘導czcC基因的表達。CopS/CopR和CzcS/CzcR兩個雙組份系統都會抑制oprD基因(細胞膜孔道蛋白)的表達。

3 討論

圖2 TCS HKs和RRs蛋白進化分析Fig.2 Phylogenetic trees of HK and RR proteins

圖3 TCS RRs蛋白結構域類型Fig.3 Conserved domain composition of TCSRR proteins

糖肽抗生素是一類重要的抗生素，是臨床上治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等“頑劣菌株”的最后一道防線。目前糖肽抗生素已經發展到第二代，都是直接來源于微生物的天然產物或衍生物。以A40926為前體的達巴萬星是第二代糖肽抗生素中活性最強的，其半衰期長達174h，臨床上一周僅給藥1次。野野村放線菌是A40926生產菌株，其全基因組已測序完成，基因組大小11.85Mb，基因組上分布有豐富多樣的TCS雙組份系統，共有213個相關HK和RR編碼基因。ATCC39727中的只有極少數TCS系統得到實驗驗證，其中途徑特異性調控基因dbv22(HK)和dbv6(RR)是一對TCS系統，但Grasso等[33]證實dbv6并不影響A40926的表達。盡管TCS系統中典型的HK蛋白含有4個保守結構域，但ATCC39727的HK蛋白的保守結構域有14種組合類型，其中最保守的結構域是HATPase，每一種組合類型都有該結構域，這種組合多樣的特征可能是由于其為了更好的適應復雜的環境變化而發生的進化。本文通過生物信息學分析初步構建了部分TCS系統的調控網絡。在此基礎上，本文將在下一步工作中重點研究ATCC39727中雙組份對A40926次級代謝途徑的影響。

圖4 ATCC39727中TCS調控網絡Fig.4 TCS regulation network in ATCC39727