不同誘變方法選育高產(chǎn)G-418菌株的比較

鐘艾玲 田敏,* 劉艷全 易欣 龍燕 雷葉明 王富強(qiáng) 劉亞洲

(1 抗生素研究與再評價四川省重點(diǎn)試驗室，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都大學(xué)，成都 610052；2 微生物藥物生物合成技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，成都雅途生物技術(shù)有限公司,成都 610041)

G-418又名遺傳霉素(geneticin)，是由小單孢菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)類似于慶大霉素和新霉素的氨基糖苷類抗生素[1-2]。它對原核和真核細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性，能抑制細(xì)胞的增值，誘發(fā)細(xì)胞凋亡等[3-4]。目前G-418作為高端生化試劑被大量應(yīng)用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，同時也可作為抗革蘭陰性菌感染新藥研究的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)物質(zhì)。

從自然中分離篩選的小單孢菌生物合成G-418能力較低[5-6]，遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。本研究以G-418產(chǎn)生菌棘孢小單孢菌為研究對象，采用多種不同作用機(jī)理的誘變方式，比較確定對該G-418產(chǎn)生菌具有最佳效果的誘變方式和劑量，并同時篩選出高產(chǎn)G-418小單孢菌菌株，為實(shí)現(xiàn)G-418工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

出發(fā)菌株為棘孢小單孢菌(Micromonospora echinoapora)，活性鑒定菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)固體平板培養(yǎng)基 酵母粉1.0g，葡糖糖1.0g，NaCl 8.5g，瓊脂20.0g，加熱溶解于水后定容至1000mL，調(diào)pH7.0～7.2，121℃滅菌30min。

(2)生物活性檢定培養(yǎng)基Ⅰ[7]蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，磷酸氫二鉀3.0g，瓊脂20.0g，加熱溶解后定容至1000mL，調(diào)pH7.0～7.2，121℃滅菌30min。

(3)種子培養(yǎng)基 酵母浸粉10.0g，葡萄糖1.0g，可溶性淀粉30.0g，加熱溶解于水后定容至1000mL，調(diào)pH7.0～7.2，121℃滅菌30min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基 淀粉40.0g，葡萄糖16.0g，蛋白胨8.0g，NH4NO33.0g，酵母粉6.0g，0.5%CoCl2·6H2O溶液250μL，玉米粉6.0g，輕質(zhì)CaCO33.0g，加熱溶解于水后定容至1000mL，調(diào)pH7.0～7.2，121℃滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 棘孢小單孢菌孢子菌懸液的制備

取培養(yǎng)5d的棘孢小單孢菌新鮮斜面，用10mL生理鹽水洗下，將孢子液轉(zhuǎn)入另一只帶有玻璃珠的三角瓶中，34℃，220r/min，震蕩30min，過濾，制成孢子濃度107～108CFU/mL的孢子懸液。

1.2.2 UV誘變條件確定

移取5.0mL制備好的孢子懸液于直徑9cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于已預(yù)熱30min的紫外箱，并放置在功率為15W的紫外燈(波長265nm)、照射距離為30cm下，照射時間分別為0、10、30、60、90和180s。每次誘變設(shè)置3個平行。處理后的孢子懸液稀釋后涂布于固體平板培養(yǎng)基，34℃恒溫避光培養(yǎng)7～10d，計數(shù)菌落。

1.2.3 NTG誘變條件確定

移取NTG溶液與孢子懸液等體積混勻，使NTG終濃度為2.0mg/mL，分別震蕩處理10、30和60min。然后加入100%硫代硫酸鈉解毒處理10min。未使用誘變劑處理的孢子懸液與處理后的孢子懸液稀釋后涂布于固體平板培養(yǎng)基，34℃恒溫避光培養(yǎng)7～10d，計數(shù)菌落。

1.2.4 微波誘變條件確定

將制備好的孢子懸液分裝至5支試管中，插入冰塊中，置于2450MHz，750W家用微波爐中，中等功率強(qiáng)度照射時間分別為10、30、60和90s。未使用誘變劑處理的孢子懸液與處理后的孢子懸液稀釋后涂布于固體平板培養(yǎng)基，34℃恒溫培養(yǎng)7～10d，計數(shù)菌落。

1.2.5 超聲誘變條件確定

將制備好的孢子懸液分裝至4支試管中，置于頻率為50Hz超聲波儀(KH2200型) 中分別處理10s、 30s、60s和120s。未使用誘變劑處理的孢子懸液與處理后的孢子懸液稀釋后涂布于固體平板培養(yǎng)基，34℃恒溫避光培養(yǎng)7～10d，計數(shù)菌落。

1.2.6 不同生長時間種子孢子懸液紫外誘變條件確定

將斜面菌種接種至種子瓶培養(yǎng)(34℃、220r/min)，移取發(fā)芽期、生長對數(shù)期、衰亡期3個階段的種子培養(yǎng)液至帶有玻璃珠的三角瓶中，220r/min震蕩30min，過濾。參照“1.2.2”項條件進(jìn)行紫外誘變。將各生長期種子未經(jīng)紫外誘變處理種子懸液及處理后種子懸液稀釋后涂布于固體平板培養(yǎng)基，34℃恒溫避光培養(yǎng)7～10d，計數(shù)菌落。

1.2.7 致死率計算

1.2.8 發(fā)酵培養(yǎng)

將挑出的菌株接斜面培養(yǎng)，待孢子成熟后，取適量接入裝有25mL/250mL種子培養(yǎng)基的種子瓶中，34℃、220r/min搖瓶培養(yǎng)30h，以10%的接種量，接入30mL/250mL發(fā)酵瓶，34℃、220r/min培養(yǎng)7d。

1.2.9 抗菌活性測定

發(fā)酵液經(jīng)2500r/min離心10min，取上清液，管碟法[7]測定抗生素的活性，根據(jù)抑菌圈直徑大小分析抗生素的效價。

2 結(jié)果

2.1 UV誘變條件選擇

使用功率為15W的紫外燈管、照射距離為30cm，對孢子菌懸液進(jìn)行0～180s的時間處理。將照射不同時間的孢子懸液進(jìn)行稀釋后涂布于平板上，34℃培養(yǎng)，計菌落數(shù)，由此得出紫外照射不同時間的致死率，為了確保菌體能夠最大程度的正向突變，在誘變研究中，工業(yè)誘變育種過程中通常將紫外致死率控制在80%左右[8]。本研究中，產(chǎn)G-418小單孢菌孢子懸液經(jīng)不同時間紫外線照射的致死率和正突變率如圖1所示。

圖1 紫外誘變時間對致死率、正突變率的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on spore lethal rate and positive mutation rate

由圖1可知，隨著照射時間的不斷增加，菌株的致死率也不斷升高，當(dāng)UV照射180s時，致死率趨于100%。本研究表明：當(dāng)照射時間為90s時，菌株的致死率達(dá)90%，此時的正突變率最高，為16.7%，因此選擇90s作為紫外誘變時間。

2.2 NTG誘變條件選擇

采用相同NTG濃度(2.0mg/mL) ，對菌株進(jìn)行0～60min不同時間處理，其致死率隨時間的變化如圖2所示。由圖2可知，NTG在2.0mg/mL的濃度下，誘變時間為60min時，致死率達(dá)到87.5%，當(dāng)NTG作用時間為30min時，菌株的致死率為61.3%，其正突變率最高為36.7%，所以選擇作用時間為30min作為NTG誘變條件。

2.3 微波誘變條件選擇

在一定頻率下，主要影響微波誘變效果的因素是微波的輻照時間[9]。選用輸出功率900W，額定頻率2450MHz的微波，對小單孢菌的孢子懸浮液進(jìn)行輻照處理，輻照時間為10、30、60和90s。輻照處理后，孢子的致死率如圖3所示。由圖3可知，隨著微波照射時間增加，菌株的致死率逐漸增高，在照射時間為90s時，菌株的死亡率接近100%，在照射時間為60s時，致死率為95.8%，菌株的正突變率最高為20%，因此選擇60s為最佳輻照時間。

圖2 NTG誘變時間對菌株的致死率、正突變率的影響Fig.2 Effects of NTG mutagenic time on spore lethal rate and positive mutation rate

2.4 超聲誘變條件選擇

在一定的溫度下，超聲波的作用時間是影響突變效率的主要因素[10]，選用頻率為50Hz的超聲波置于冰水中處理0～2min，孢子的致死率如圖4所示。

由圖4可知，隨著處理時間時間增加，超聲誘變致死率逐漸增高，在照射時間為60s時，菌株致死率為90%，其正突變率最高為16.7%，因此選擇60s為誘變最佳作用時間。

2.5 誘變菌株篩選

挑取各誘變劑處理后的單菌落至斜面培養(yǎng)，斜面成熟后接入種子瓶培養(yǎng)30h，后轉(zhuǎn)種至發(fā)酵瓶，發(fā)酵周期為7d。放瓶時取發(fā)酵液離心，離心上清液稀釋一定的倍數(shù)，采用管碟法，以枯草芽孢桿菌為試驗菌，以原始菌株為參照，發(fā)酵單位高于原始菌株的誘變菌株為正突變菌株，各誘變劑誘變結(jié)果如表1。由表1可知，NTG誘變的正突變率高于其他誘變方法，高達(dá)36.7%，超聲誘變和紫外誘變的正突變率較低，為16.7%，但NTG處理后菌株的發(fā)酵單位較原始菌株僅提高36%，紫外誘變處理孢子后正突變幅度最大，發(fā)酵單位可提高102%。

圖3 微波輻照時間對菌株致死率、正突變率的影響Fig.3 Effects of microwave irradiation time time on spore lethal rate and positive mutation rate

圖4 超聲誘變時間對菌株致死率、正突變率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic mutagenic time on spore lethal rate and positive mutation rate

表1 不同誘變處理方式結(jié)果Tab.1 Result of different mutagenic

2.6 紫外線對不同生長時期菌種的誘變結(jié)果

2.6.1 種子生長曲線的繪制

將斜面成熟后的菌絲接入種子瓶中，220r/min，34℃培養(yǎng)。定時對種子培養(yǎng)液中的生物量、殘?zhí)恰H進(jìn)行測定并涂片觀察菌絲狀態(tài)，繪制種子生長曲線，結(jié)果如圖5。根據(jù)種子生長曲線及菌絲生長形態(tài)，得到菌株的生長特點(diǎn)，0～15h為萌芽期，15～42h為對數(shù)生長期，42～44h為穩(wěn)定期，44～55h為種子衰亡期，可以看出其穩(wěn)定期較短，考慮具體實(shí)驗，選擇萌芽期、對數(shù)生長期以及種子衰亡期進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

圖5 種子生長曲線Fig.5 The growth curve of micromonospora echinoapora seed

2.6.2 不同生長時期紫外誘變

參照“2.6.1”項結(jié)果，對種子萌芽期、對數(shù)生長期及衰亡期的種子液進(jìn)行紫外誘變，分別挑取誘變后在固體平板上生長的單菌落至斜面培養(yǎng)，按照“1.2.8”項方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，活性評價，篩選結(jié)果如表2。由表2可知，菌種在不同生長時期對紫外誘變的效應(yīng)不同，分別將原始菌株產(chǎn)G-418的效價提高了73%～115%。其中，種子液衰亡期的紫外誘變的正突變率高于其他生長時間，高達(dá)46.7%，且正突變幅度最大，突變菌株最高單位為1023μg/mL。由此可見，選擇種子液衰亡期進(jìn)行紫外誘變，有望獲得G-418的高產(chǎn)突變菌株。

3 結(jié)論

采用紫外誘變、NTG誘變、微波誘變和超聲誘變和不同生長時期種子液的紫外誘變5種方法分別對產(chǎn)G-418小單孢菌進(jìn)行處理。比較各種誘變劑，雖然NTG能夠得到較高的正突變率，但突變幅度小，NTG處理后菌株發(fā)酵單位僅提高36%。紫外線對該G-418產(chǎn)生菌具有較好的誘變效應(yīng)，在經(jīng)典的菌種選育研究中，采用紫外線作為誘變劑時，處理對象通常是孢子懸液，而本實(shí)驗采用對衰亡期種子液進(jìn)行誘變處理，得到了較高的正突變率與產(chǎn)量，當(dāng)衰亡期種子液經(jīng)紫外誘變處理90s后，其正突變率可達(dá)46.7%，且突變幅度大。本研究最終篩得優(yōu)良菌株UV-1和UV-衰亡期-9，G-418效價分別比原始菌株提高102%和115%。

表2 不同生長期種子UV誘變處理正突變率結(jié)果Tab.2 Result of UV mutagenic at different growth stages on positive mutation rate