響應面法優化頭孢菌素C發酵條件

李寧慧 李凌峰 金志華

(浙江大學寧波理工學院生物與化學工程學院，寧波 315100)

頭孢菌素類抗生素具有抗菌活性強、抗菌譜廣、耐β-內酰胺酶、毒副作用小等優點，是臨床治療細菌性感染的重要藥物[1]。迄今為止，頭孢菌素類抗生素全球已上市了50多個品種，占抗感染藥物市場的50%，是目前世界上銷售額最大的抗生素之一[2]。我國自20世紀70年代生產第一代頭孢菌素產品以來，已有40多種頭孢菌類抗生素用于臨床。而與全球市場中頭孢菌素類抗生素銷售額逐漸減緩的趨勢不同，近年來國內頭孢菌素類抗生素產品正處于快速增長期，銷售額年增長率超過30%，超過了國內醫藥產品的平均增長速率，未來幾年頭孢菌素原料藥可能會出現更大競爭[3-5]。因此，關于頭孢菌素類抗生素發現、生產和應用的研究方興未艾。

頭孢菌素C(cephalosporin C,CPC)是頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)的代謝產物。雖然CPC的抗菌活力低于青霉素G，但由于其毒性和過敏性較低，可作為合成7-氨基頭孢烷酸的前體，生產多種低毒、廣譜和高效的新型頭孢菌素類抗生素。因此，不少學者對頭孢菌素C的發酵條件研究，取得了顯著的成果[6-10]。本課題組進行了頭孢菌素C合成菌株的篩選研究，獲得了一株高產頭孢菌素C的頂頭孢霉；由于該菌株的頭孢菌素C產量顯著高于已報道的菌株的產量，對該菌株產頭孢菌素C的發酵條件進行了研究，以提高頭孢菌素C的發酵產量，并豐富對頂頭孢霉代謝和頭孢菌素C發酵研究的認識，為深入揭示頂頭孢霉中頭孢菌素C的合成機理和調節機制提供信息[11]。

由于影響頂頭孢霉發酵生產頭孢菌素C的因素較多，為了不遺漏關鍵的因素，以及諸因素間可能的交互效應，同時為了提高研究的效率，在實驗中采用了Plackett-Burman法和響應面方法進行了研究。Plackett-Burman實驗(以下文中簡稱PB實驗設計)，能從眾多變量中快速篩選出重要的因素；響應面方法(response surface methodology,RSM)能將實驗設計和數學建模綜合起來，給出指標和因素的關系式，從而得到準確有效的實驗結論[12]。近年來，PB實驗設計、RSM等統計優化方法越來越受到重視，在各行業中得到廣泛應用，尤其是微生物發酵條件優化的研究中[13-16]。本文從大量菌株中篩選出頂頭孢霉高產菌株，采用響應面法對頭孢菌素C液體發酵中的各因素進行考察及評價，在搖瓶中對頭孢菌素C的發酵條件進行了優化，為后續放大培養提供了可靠依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)，實驗室低溫保存。

斜面培養基(g/L)：燕麥片24，麥芽糖10，酵母提取物1，瓊脂粉20，Na2SO41，pH6.4。

一級種子培養基(g/L)：黃豆餅粉30，金槍魚浸膏20，玉米漿7.5，蔗糖5，葡萄糖10，CaCO35，豆油0.1，pH7.0。

二級種子培養基(g/L)：工業花生餅粉28，黃豆餅粉28，金槍魚浸膏20，玉米漿15，蔗糖25，葡萄糖10，CaCO35，豆油0.1，pH7.0。

發酵培養基(g/L)：工業花生餅粉24，金槍魚浸膏20，玉米漿13，DL-蛋氨酸7，玉米粉20，果葡糖漿35，工業小麥面筋粉38，(NH4)2SO48，CaSO412，CaCO334，豆油0.1，pH7.2。

以上培養基1×105Pa滅菌30min。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂頭孢霉菌的篩選

取1mL的10%甘油孢子懸浮液稀釋，分別取稀釋為10-1、10-2和10-3的菌懸液各0.1mL涂布于培養基平板，28℃培養3～4d至單菌落出現，菌落長到1～2mm，挑選白色、菌落直徑大、隆起高、沒有裂縫的單菌落接種一級種子培養液，在28℃，190r/min的搖床培養4d。取一級種子培養液，用生理鹽水稀釋10倍，然后取1mL，加入二級種子瓶中，搖床培養，轉速：210r/min，培養溫度：28℃，培養時間：4d。取2mL二級種子培養液，加入含1.5mL豆油和10mL的發酵培養基的搖瓶中，置于搖床培養，轉速：280r/min，溫度：28℃，培養7d。取發酵液測定頭孢菌素含量，篩選高產菌株并保存備用。

1.2.2 頭孢菌素C的液體發酵

將篩選得到的高產菌株經活化后，分別接種于一級、二級種子液中培養，取一定稀釋倍數的二級種子液接種至經PB試驗設計的液體發酵培養基中，于選定溫度下，轉速為280r/min的搖床培養7d后測定培養基中頭孢菌素C含量。

1.2.3 頭孢菌素C的濃度測定

采用HPLC法測定[6]。發酵液中頭孢菌素的提取：用定性濾紙過濾發酵液，吸取1mL上清液，再加入4mL甲醇和5mL純水，充分搖勻，再取1mL與稀釋液與9mL純水混合，搖勻后用0.22μm微孔過濾器過濾備用[11]。

1.3 頭孢菌素C發酵培養基的優化

1.3.1 Plackett-Burman設計篩選重要影響因素

PB設計是一種二水平的實驗設計方法，主要通過對每個因素取高低兩個水平，即以“+”、“-”分析，低水平一般為原始水平，高水平一般為原始水平的1.5倍左右，但主要還是視具體實驗情況而定。它以N次實驗來考察最多N-1個變量，還應留足空項(或稱虛擬變量)用于方差分析。在N次的PB實驗中，每個變量的“高”、“低”水平分別出現N/2次，可計算出此因素的效應，當某個因素處于“高”、“低”水平時，其余因素均出現N/4次，其他因素的效用將正負抵消而消除。對結果進行多元線性回歸分析，并通過F檢驗進行效應顯著度的統計學檢驗[17]。本實驗考察11個影響因素，余留4個空項，所以選用N=16的PB試驗設計，如表1安排實驗，各代號對應的實際變量“+”、“-”和水平相應的真實值見表2。

1.3.2 最陡坡試驗

最陡坡法也叫最陡(速)上升法(method of steepest ascent)，是一種多因素試驗的設計方法。首先用正交試驗查找最陡坡，使各因素水平的變動幅度與各自效應的大小成比例；然后沿最陡方向即目標相應升高方向安排一批試驗點，根據響應目標對該效應的敏感度確定步長，調節至實驗指標最優化；最后以最優點為中心安排實驗[18]，檢驗頭孢菌素C發酵產量的最高區域。根據PB實驗結論，安排最陡坡實驗見表3。此法可明顯減少實驗次數，縮短實驗周期。

1.3.3 中心復合試驗

中心復合試驗設計(central composite design,CCD)采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的模型[17]。通過最陡坡實驗確定頭孢菌素C發酵產量最高區域后，選用中心復合設計對數據進行統計分析，具體實驗設計如表4，各因素及其水平見表5。利用Design-Expert 8.0軟件對表4中數據擬合得到一個二階數學模型，求解得到最高頭孢菌素C產量最優化發酵條件，由三維響應面圖直觀顯示出優化結果。

1.3.4 驗證實驗

對頭孢菌素C產量的預測值進行實驗驗證，安排在該預測之下的最優發酵條件，比較真實值和預測值，確定優化結果。

2 結果與分析

2.1 頂頭孢霉的篩選

從分離平板中選出了18個白色、隆起高、菌落直徑大、沒有裂縫的單菌落，編號1～18，將單菌落的一半準備接種到種子培養基中，另一半接種至斜面培養基上保藏菌種。

取對應的菌株編號轉接到種子培養液中，再經一級、二級種子液培養后轉接至發酵培養基中，發酵7d后取樣測定頭孢菌素C的含量。從甘油孢中篩選得到一株頂頭孢霉高產菌G3-7，發酵液中的頭孢菌素C含量達到32.59g/L。與已報道的多株產頭孢菌素C的頂頭孢霉相比，該菌株的頭孢菌素C發酵產量較高[6-10]，表明該菌株在代謝性能、特別是頭孢菌素C合成代謝途徑方面，具有與已報道菌株不同的特征，具有重要的研究價值。

2.2 頂頭孢霉液體發酵條件優化研究

表1 Plackett-Burman的實驗與結果(N=16)Tab.1 Experimental and results of the Plackett-Burman design for 16 trials

表2 Plackett-Burman設計各因素水平、效應Tab.2 Levels and effect of variables for Plackett-Burman design

表3 最陡坡試驗設計及結果Tab.3 Experimental design of steepest ascent and the corresponding results

表4 中心復合試驗設計及其響應值Tab.4 Experimental design and the actual and predicted values of cephalosporin C by CCD

表5 中心復合設計因素變量及其水平Tab.5 Levels and code of variables for CCD

2.2.1 影響頂頭孢霉液體發酵的重要因素

由表2中P值大小可知，金槍魚浸膏和蛋氨酸濃度是對頭孢菌素C發酵產量有顯著影響的重要因素：前者存在顯著的正效應，濃度需進一步增加；后者存在顯著的負效應，當前使用濃度過高，應適當降低。玉米漿和花生餅粉濃度以及發酵溫度也有一定的影響，而培養基中的其它成分，如果葡糖漿等的濃度以及pH值、裝液量、接種量對發酵產量均無顯著影響。這說明對于高產菌株G3-7發酵產生頭孢菌素C的過程而言，金槍魚浸膏和蛋氨酸是兩種重要的營養要素。金槍魚浸膏的主要成份是魚蛋白酶解而成的短肽鏈，富含20多種氨基酸、多種B族維生素、有機微量礦物質、牛磺酸和不飽和脂肪酸等物質，不僅可以為菌株的生長和代謝提供氮源、維生素和不飽和脂肪等營養要素，而且其中的有機微量礦物質有助于提高菌體內相關代謝酶的活力，促進頭孢菌素C合成途徑的活力，進而有助于頭孢菌素C的合成。本研究后期采用國內海產品加工廠廢角料生產的魚精膏代替進口金槍魚浸膏，兩者相比，頭孢菌素C產量基本相當，但魚精膏更加便宜。蛋氨酸在誘導頭孢菌素C的合成過程中不僅是硫的供應者，還有一些其他重要作用，不能被其他化合物所取代，可能原因包括：1)誘導擴環酶，環化酶，ACV合成酶等；2)為合成頭孢菌素C所需的半脫氨酸提供硫原子[19]。因此，在后續實驗中，對培養基中金槍魚浸膏和蛋氨酸的濃度進行了進一步的優化研究。

2.2.2 最陡坡試驗

為了保證響應面實驗的順利進行，首先采用最陡坡實驗法對金槍魚浸膏和蛋氨酸濃度進行了搜索，以確定存在極值的區域。根據表2中這二因素的水平、效應值，確定其變化方向及步長進行最陡坡試驗，實驗設計及結果見表3。

顯然，實驗4的頭孢菌素C產量最高，為35.91g/L。根據響應面CCD實驗的設計原理，選取頭孢菌素C液體發酵的最優發酵條件即第4組實驗為中心點設計。

2.2.3 響應面法優化實驗條件

根據最陡坡實驗，響應面變量逼近最大產量區域，以最陡坡實驗中的4號配方為中心點用中心復合法設計試驗，設計成2因素5水平，表4是2因素的編碼及取值，表5是試驗設計及其響應值。

根據實驗結果，利用Design-expert 8.0軟件，二次多項式回歸得到的二次經驗模型為：頭孢菌素C的產量(g/L)=35.82-0.11A+0.56B-0.71AB-1.99A2-0.54B2。

模型整體方差分析(表6)表明：F值為41.532，P＜0.001，說明模型是成立的，有統計學意義。模型決定系數為0.967，說明響應值的變化96.7%來源于所選因素，模型擬合良好。此外，方差分析中的變異系數、信噪比均反映數據合理，模型的可信度高，可重復性好，精確度高，能準確地反映實驗結果。因此可以認為該經驗模型可以用來預測頭孢菌素C發酵產量。對擬合的方程求解得：當金槍魚浸膏為34.32g/L、蛋氨酸為6.52g/L時，頭孢菌素C的產量為35.99g/L。圖1是金槍魚浸膏和蛋氨酸影響頭孢菌素C產量的響應面圖及等高線。

在已有對頂頭孢霉發酵制備頭孢菌素C的研究中，研究者發現對發酵水平存在顯著影響的關鍵因素為碳源、氮源和磷源等因素。雖然表2顯示蛋氨酸濃度呈現負效應，但其原因在于培養基中添加的蛋氨酸濃度較高(10.5g/L)，因為在前期單因素優化研究中發現，添加蛋氨酸可以顯著增加頭孢菌素C的發酵水平。之所以在PB實驗中蛋氨酸濃度過高，這可能與多因素之間的交互效應有關。經最陡坡實驗和響應面方法建模，表明在培養基中添加6.5g/L的蛋氨酸有助于頭孢菌素C的合成，與文獻報道用量基本一致[19]。蛋氨酸的主要生理作用是提供一碳單位，參與核酸等多種物質的合成，并且具有抗氧化功能。因此，蛋氨酸有可能通過提供一碳單位的作用，參與頭孢菌素C的合成或其調控，此外，蛋氨酸中還含有硫元素，這也可能是蛋氨酸影響頭孢菌素C合成的一個原因。桑美納等[7]在進行頭孢菌素C補料發酵優化研究中，之所以選擇硫酸銨而不是氨水，其原因在于前者不僅可以提供氮源，而且還能為CPC合成提供硫源。因此，蛋氨酸增加頭孢菌素C發酵的產量的原因一方面可能與其提供的一碳單位有關，另一方面還與其提供的硫元素有關。但具體機制有待進一步研究。

表6 二次模型回歸方程系數的方差分析Tab.6 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

圖1 金槍魚浸膏和蛋氨酸影響頭孢菌素C產量的響應面圖及等高線Fig.1 Surface and contour plots of mutual-influence for tuna ottelia alismoides concentration and DL-mertioninon the yield of cephalosporin C production

2.3 優化后發酵培養基結果檢驗

在此條件下驗證該實驗的可靠性，選擇最優發酵條件，以此條件重復實驗3次，頭孢菌素C的平均產量為35.946g/L，與理論預測值較為接近，誤差小于5%。驗證證明該模型能較好地預測實際發酵情況，可應用于頂頭孢霉發酵條件優化。優化后頭孢菌素C的產量較優化前提高了10.4%。

3 結語

利用自然篩選的方法分離頂頭孢霉菌的策略，分離得到一株高產頭孢菌素C的菌株，在培養基中添加蛋氨酸可增加該菌株的頭孢菌素C合成，產量達到32.59g/L。采用PB設計方法及響應面法相結合的實驗設計方法對頭孢菌素C液體發酵培養條件優化，優化后的發酵培養基配方為：金槍魚浸膏34.32、DL-蛋氨酸6.52、花生餅粉24、玉米漿13、玉米粉20、果葡糖漿35、工業小麥面筋粉38、(NH4)2SO48、CaSO412、CaCO334、豆油0.1，pH7.2，在此條件下的頭孢菌素C產量達到了35.99g/L。實驗表明，響應面法對于縮短頭孢菌素C液體發酵試驗周期，減少實驗次數都有很好的作用。此法求得回歸方程精度高，可考察各因素間的交互作用，是研究初期優化加工條件、降低開發成本、提高產物產量等實際問題的一種有效辦法。