毛細管電泳法測定硫酸多黏菌素B中的有關(guān)物質(zhì)

張含智 秦峰 徐曉曦 劉浩

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

多黏菌素B(polymyxin B sulfate,PMB，結(jié)構(gòu)通式如圖1所示)是一類由多黏芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的多肽類抗生素混合物，其硫酸鹽主要用于治療多重耐藥革蘭陰性菌，被稱為“抗擊超級細菌的最后一道防線”[1-4]。PMB組分之間較為相似，其主要結(jié)構(gòu)為N-端脂肪鏈(FA)、α,γ-二氨基丁酸及氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸等)經(jīng)酰胺鍵連接而成，4位及5位α,γ-二氨基丁酸結(jié)合形成環(huán)七肽，邊鏈包括FA及三肽。已知的主要成分為PMB1、PMB2、PMB3及PMB1-I，差別在于FA取代基或氨基酸不同，具體區(qū)別見表1。

表1 多黏菌素B組分信息表Tab.1 The characteristics of known components in Polymyxin B

目前，中國藥典(ChP)2015年版[5]、美國藥典(USP)40版[6]、歐洲藥典(EP)9.0版[7]均采用液相色譜法分析PMB中的組分及有關(guān)物質(zhì)，通過相對保留時間對主要組分進行定性分析。對于PMB中的微量組分，Govaerts等[8-10]通過制備色譜及液質(zhì)聯(lián)用方法推斷了約30種有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。張含智等[11]根據(jù)HPLC-MS/MS推斷了PMB中一種具有雙鍵結(jié)構(gòu)的組分，其結(jié)構(gòu)需進一步鑒定。崔阿龍等[12-13]通過化學(xué)合成PMB中的單一組分，為構(gòu)效關(guān)系研究及單一組分對照品制備奠定了基礎(chǔ)，并揭示出某些單一組分的抗菌活性較總組分要高，且毒性要低。毛細管電泳(CE)方法對于復(fù)雜體系具有較好的分離效果，是液相色譜良好的正交補充方法。Kristensen等[14]將兩性離子表面活性劑PAPS作為假固定相加入到緩沖液中，對PMB組分的分離選擇性較好，但組分之間出峰時間較集中且主峰有明顯的拖尾現(xiàn)象。Kang等[15]選擇甲基-β-環(huán)糊精作為添加劑，建立了PMB的CE定性定量方法，該方法柱效高、穩(wěn)健性好；本文采用該方法分析國產(chǎn)注射用硫酸PMB時，發(fā)現(xiàn)PMB1與相鄰雜質(zhì)的分離度較差。

為建立適用于國產(chǎn)硫酸PMB有關(guān)物質(zhì)分析的CE方法，避免雜質(zhì)對PMB定量產(chǎn)生影響，建立了羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、異丙醇作為分離添加劑、三乙醇胺(TEA)-磷酸緩沖液的CE方法。通過優(yōu)化HP-β-CD及異丙醇的含量，開展線性、檢測限、精密度等方法學(xué)考察，確立了最優(yōu)的分析方法，最終應(yīng)用于硫酸PMB原料藥及制劑有關(guān)物質(zhì)的檢測中，為國產(chǎn)樣品的質(zhì)量控制提供了一種可供借鑒的檢測方法。

1 儀器與試藥

Agilent G1600AX型高效毛細管電泳儀(美國Agilent Technologies公司)，熔融石英毛細管(60cm，50μm，河北永年光導(dǎo)纖維廠)。

ChP 2015年版多黏菌素B(批號：130313-201310)標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院(中檢院，ZJY)，USP硫酸多黏菌素對照品(批號：N1M425)，硫酸多黏菌素B原料藥(批號：A1411105)、注射用硫酸多黏菌素B(批號：1512801、1512802、1512803)均由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供。乙腈為色譜純，三乙醇胺、磷酸和異丙醇均為分析純，水為超純水。α-CD、β-CD、甲基-β-CD、HP-β-CD均購自Sigma-Aldrich。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

運行緩沖液：130mmol/L三乙醇胺溶液用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5，加入5%(V:V)異丙醇與30mmol/L HP-β-CD，出口緩沖液瓶中不含HP-β-CD。

對照品溶液：精密稱取硫酸PMB標(biāo)準(zhǔn)品(USP，PMB1含量69.7%)20mg，加2mL溶劑(水:乙腈=80:20)溶解，作為對照品儲備液S1，濃度為10mg/mL，其中PMB1濃度為6.97mg/mL。

供試品溶液：精密稱取硫酸PMB原料藥及制劑50mg置于10mL量瓶中，加溶劑溶解，定容，搖勻，作為原料藥供試品溶液，臨用現(xiàn)制。制劑中含有50mg硫酸PMB，加溶劑溶解并全部轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，定容，搖勻，作為制劑供試品溶液。

2.2 實驗條件

工作電壓24kV；柱溫25℃；檢測波長215nm；進樣壓力50mbar，進樣時間3s。毛細管初次使用時，依次用1mol/L氫氧化鈉溶液沖洗20min，蒸餾水沖洗5min，再用運行緩沖液沖洗20min。每次分析后用運行緩沖液沖洗3min。

在上述實驗條件下，分別取對照品及供試品溶液進樣分析。

2.3 線性及精密度試驗

取對照品儲備液S1經(jīng)溶劑逐級稀釋至PMB1的濃度為3.485(S2)、1.394(S3)、0.697(S4)、0.3485(S5)、0.0697(S6)、0.03485(S7)和0.01394mg/mL(S8)，分別進樣測定并記錄電泳圖，以PMB1峰面積A對濃度c(S6-S1)進行線性回歸，得回歸方程為：A=103.2c+4.3062，R2=0.9999。

精密度試驗中，PMB1峰面積及遷移時間的天內(nèi)重復(fù)性的RSD值分別為0.53%和0.60%(n=6)，天間的RSD值分別為0.65%和0.69%(n=3)，說明本方法的重復(fù)性較好。LOD(S/N=3)為13.94μg/mL，LOQ(S/N=10)為34.85μg/mL。

2.4 樣品測定

取中檢院標(biāo)準(zhǔn)品、USP對照品、企業(yè)原料藥及3批制劑進行測定，并對結(jié)果進行比較分析。

3 結(jié)果與討論

由于PMB屬于發(fā)酵產(chǎn)品，不同的菌種及生產(chǎn)環(huán)境導(dǎo)致組分之間的差異較大，已有方法可能不適用于不同企業(yè)的PMB的分析。如采用文獻[14]中的CE方法檢測上海第一生化藥業(yè)有限公司的硫酸PMB時，組分出峰時間較為集中，且B1與相鄰峰的分離并不理想，見圖2A；采用文獻[15]的方法，B1、B1-I分別與相鄰雜質(zhì)未實現(xiàn)基線分離，改變其中的三乙醇胺、甲基-β-CD及異丙醇的含量，未有明顯的改善效果，見圖2B，且兩種方法均存在主峰拖尾的情況。本研究在此基礎(chǔ)上，通過篩選其他不同的環(huán)糊精(如α-CD、β-CD、HP-β-CD)，發(fā)現(xiàn)HP-β-CD較適合于PMB各組分的分離，并考察了三乙醇胺、HP-β-CD及異丙醇對分離的影響，篩選出最優(yōu)的緩沖液條件。

圖2 PMB分離的典型色譜圖Fig.2 The typical chromatogram of PMB

3.1 緩沖液組成對分離效果的影響

三乙醇胺緩沖液經(jīng)H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.5后，熔融石英毛細管管壁的硅羥基在該條件下幾乎不解離，避免了電滲流對分離的影響。PMB各組分根據(jù)各自不同的電泳淌度進行分離，同時由于降低了正電性多肽在管壁的吸附，提高分析重復(fù)性。

固定三乙醇胺(130mmol/L)及HP-β-CD(30mmol/L)的含量，考察緩沖液中異丙醇的含量對分離選擇性的影響。緩沖液中無異丙醇時，PMB2、Ile-PMB1與PMB1在較集中的時間內(nèi)遷移出峰，掩蓋了較多的微量雜質(zhì)。隨著異丙醇含量的增加，PMB各組分之間的分離度增大，說明該有機溶劑對分離有明顯地改善效果；但分析時間延長，如異丙醇為10%時，PMB1遷移時間為38min。最終確定緩沖液中異丙醇的含量為5%。

當(dāng)固定三乙醇胺(130mmol/L)及異丙醇(5%)的含量時，發(fā)現(xiàn)HP-β-CD的含量對PMB的分離選擇性具有明顯的影響。調(diào)整HP-β-CD含量從10、20和30mmol/L變?yōu)?0mmol/L，隨著HP-β-CD濃度的增加，PMB各組分的遷移時間逐漸增大，見圖3，說明PMB與HP-β-CD之間的相互作用增強，導(dǎo)致組分之間的分離選擇性增大。PMB1與PMB1-I逐漸分離開，兩者之間的微量雜質(zhì)峰被檢測到；但PMB2與PMB1-I之間的分析時間縮短，導(dǎo)致HP-β-CD在40mmol/L時，有較多的微量雜質(zhì)被包埋在PMB1-I峰中。綜合考慮以上因素，確定HP-β-CD濃度為30mmol/L。

3.2 CE對不同硫酸PMB的檢測結(jié)果

采用“3.1”項中篩選到的最優(yōu)的分離條件，即緩沖液中含有30mmol/L HP-β-CD、5%異丙醇的130mmol/L三乙醇胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)，對中檢院標(biāo)準(zhǔn)品、USP對照品、硫酸PMB原料藥及制劑進行檢測。按照ChP 2015年版中硫酸多黏菌素B有關(guān)物質(zhì)項下規(guī)定，單個雜質(zhì)不得過3.0%，雜質(zhì)總量不得過17.0%，根據(jù)峰面積歸一化計算以上樣品中單個雜質(zhì)及雜質(zhì)總量，見表2。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，企業(yè)樣品中的單個雜質(zhì)及雜質(zhì)總量均在規(guī)定限度之內(nèi)。與液相方法(按照ChP 2015年版硫酸多黏菌素B有關(guān)物質(zhì)項下的分析方法)結(jié)果進行比較，最大單個未知雜質(zhì)之間的差別較小，但總雜質(zhì)含量差別較大，可能原因是在毛細管電泳中進樣體積較液相進樣體積小，造成某些微量雜質(zhì)未被檢測到，應(yīng)需要增加進樣體積。

圖3 HP-β-CD對PMB分離選擇性的影響Fig.3 The effect of HP-β-CD on the separation selectivity of PMB

表2 PMB中有關(guān)物質(zhì)的含量Tab.2 The contents of relative substances in PMB

4 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種CE方法用于PMB中的有關(guān)物質(zhì)分析，采用HP-β-CD作為緩沖液改性劑可以提高分離的選擇性。本法靈敏度較高、重復(fù)性較好，可以作為藥典中液相方法的補充方法對PMB中的有關(guān)物質(zhì)進行定量分析，為國產(chǎn)藥品的質(zhì)量控制提供了一種可供選擇的方法。