基質輔助激光解析電離飛行時間質譜檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌δ-毒素的應用

郭慶昕 楊濱 強華

(1 福建中醫藥大學附屬泉州市正骨醫院，泉州 362000；2 福建醫科大學附屬第一醫院檢驗科，福州 350005；3 福建醫科大學，福州 350122)

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術可用于蛋白質、核酸、多糖等多種生物分子的分子量和結構分析，其基本原理是：在基質輔助激光解析的離子源部分，基質與樣本形成共晶體后，從激光中吸收能量使樣本解吸，基質與樣本間發生電荷轉移使得樣本分子電離；在飛行時間質譜分析器部分，離子在電場作用下加速飛過管道，飛行時間與離子的質荷比成正比，根據到達檢測器的飛行時間可測出質荷比，通過軟件處理得到特征性的指紋圖譜[1]。Holland等[2]應用MALDI-TOF MS在無前處理的前提下獲得全菌的蛋白指紋圖譜，與數據庫中細菌質譜進行比較，鑒定細菌至屬、種，乃至亞種的水平，使得細菌鑒定變得更加快速準確。蛋白質約占細菌干重的50%，其表達由遺傳性狀決定，受外界環境影響較小，具有多樣性、豐富性、易于提取和分離且不需要擴增的特點，因此成為MALDI-TOF MS技術鑒定細菌的最主要生物標志[3]。

隨著金黃色葡萄球菌MALDI-TOF MS圖譜中不同的蛋白和多肽的本質逐漸被揭示，發現許多小分子多肽的實質為金黃色葡萄球菌產生的毒力因子，如酚可溶性調節肽(PSM)家族中的PSMa1、PSMa2、PSMa3[4]、PSMa4[5]和δ-毒素[6]等。其中δ-毒素是最早被認識的PSM家族成員，含26個氨基酸的多肽，最初被描述成一種蛋白質，但它實際上更傾向于寡聚化的多肽[7]，由輔助基因調節子(agr)群體感應系統的調控分子RNAIII編碼[8]。研究人員發現δ-毒素還有一個同基因變異體，是由于hld基因中的非同義突變(從甘氨酸密碼子GGT到絲氨酸密碼子AGT)，導致在10位由絲氨酸取代甘氨酸的δ-毒素(HldG10S)[9]。Gagnaire等[6]使用MALDI-TOF MS檢測δ-毒素，并證實(3005±5)m/z對應野生型的δ-毒素(分子量3005.3Th)，(3035±5)m/z峰對應δ-毒素G10S變異體(分子量3035.8Th)。

本研究使用MALDI-TOF MS采集83株臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)蛋白指紋圖譜，使用儀器配套軟件分析δ-毒素產生在MRSA的分型和毒力表達的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源

83株實驗菌株來自于某綜合三甲醫院臨床分離的非重復菌株，按美國疾病預防控制中心的社區獲得性MRSA(CA-MRSA)定義：患者在門診或入院48h內分離到MRSA菌株，1年內無住院或與醫療機構接觸史，沒有留置各種導管及其他穿透皮膚的醫用裝置，將實驗菌株分成醫院獲得性MRSA(HA-MRSA)組與CA-MRSA組。SCCmec分型標準菌株為同濟大學附屬上海肺科醫院余方友教授饋贈。

1.1.2 主要試劑

血瓊脂平板、革蘭陽性菌GP鑒定卡、革蘭陽性菌GP67藥敏卡(均購于法國Bio-Mérieux公司)，甲酸、乙腈、α-氰基-4-羥基肉桂酸(均購于BrukerDaltonique)，實驗引物(上海生工生物工程有限公司合成)，PCR反應試劑包(購于大連寶生TaKaRa有限公司)。

1.1.3 主要設備

Vitek-2全自動細菌檢測系統(購于法國Bio Mérieux公司)，microflex型基質輔助激光解析電離飛行時間質譜、MALDI Biotype2.0軟件、clinProTools 3.0軟件、flexAnalysis軟件(均購于BrukerDaltonique)，PCR擴增儀(購于Eppendorf有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 δ-毒素(hld)基因

擴增引物和實驗方法參照文獻[10]，選取部分擴增產物送上海生工生物工程有限公司進行測序確認。

1.2.2 基因分型

SCCmec分型擴增引物和實驗方法參照文獻[11]，結果判讀以Marker為基準，結合SCCmec標準菌株在相應位置出現熒光條帶為陽性。spa分型擴增引物和實驗方法參照官方網站推薦方案，將擴增產物送上海生工生物工程有限公司測序，登陸官方網站http://spa.ridom.de/spatypes，查詢各菌株的spa分型。

1.2.3 MRSA 蛋白指紋圖譜的采集

樣本前處理按照儀器說明書進行，采用甲酸萃取法提取全菌蛋白，吸取1μL提取液于96孔靶板上，每個樣品檢測3孔，室溫下干燥。每個樣品用1μL用α-氰基-4-羥基肉桂酸-50%乙腈-2.5%三氟乙酸(HCCA)中的飽和溶液覆蓋，并在室溫下干燥。使用Bruker microflex MALDI-TOF儀器采集在2000～20000Da的質量范圍內的正線性模式圖譜，記錄每一圖譜的使用500個激光照射。從測量到鑒定的整個過程中保證儀器在沒有任何外界因素干擾的情況下自動進行。

1.2.4 數據分析

使用儀器配套的MALDI Biotyper 2.0、flexAnalysis軟件分析MRSA菌株的蛋白指紋圖譜，ROC曲線使用clinProTools 3.0軟件分析；χ2檢驗采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 MRSA基因檢測結果

83株MRSA中HA-MRSA39株，CA-MRSA44株。SCCmec分型檢出4個分型，SCCmecⅠ1株(1.2%)SCCmecⅡ 3株(3.6%)SCCmecⅢ 54株(65.1%)SCCmecⅣa 24株(28.9%)；39株HA-MRSA中SCCmecⅠ 1株(2.6%)SCCmecⅡ 3株(2.7%)SCCmecⅢ 32株(82.1%)SCCmecⅣa 2株(5.1%)未知分型1株(2.6%)；44株CA-MRSA中SCCmecⅢ 22株(50.0%)SCCmecⅣa 22株(50.0%)。spa分型中83株MRSA共檢出15個型，主要分型為t437共33(39.8%)株，t062共18(21.7%)株，t015共9(10.8%)株；HA-MRSA的主要spa分型t437為11(28.2%)株，t062為9(23.1%)株，t015為4(10.3%)株，t030為4(10.3%)株；CA-MRSA中t437為22(50.0%)株，t062為9(20.5%)株，t015為5(11.4%)株。所有菌株均檢出hld。

2.2 MRSA δ-毒素產生情況

本研究中共有39(47.0%)株MRSA檢出(3005±5)m/z信號峰(圖1)，其中HA-MRSA 19(22.9%)株，CAMRSA 20(26.5%)株，P=0.766，兩者之間無顯著性差異；另外共有33(39.8%)株MRSA檢出(3035±5)m/z信號峰(圖2)，其中HA-MRSA 9(10.8%)株，CA-MRSA 24(28.9%)株，P=0.003，兩者之間有顯著性差異；有11株MRSA即未檢出(3005±5)m/z信號峰，也未檢出(3035±5)m/z信號峰(圖3)，全部為HA-MRSA(表1)。

圖1 δ-毒素野生型質譜峰(3005±5)m/zFig.1 The spectrum of the δ-toxin wild-type (3005±5m/z)

圖2 δ-毒素G10S變異體質譜峰(3035±5)m/zFig.2 The spectrum of the δ-toxin G10S variant (3035±5)m/z

在spa分型中檢出(3005±5)m/z信號峰的15(18.1%)株為t062型，8株為t015(9.6%)型，4株為t030(4.8%)株，2株為t071(2.4%)株，2株為t091(2.4%)株，另外8株其他spa分型；檢出(3035±5)m/z信號峰的31(37.3%)株為t437型、2(2.4%)株t8660型(表2)。有11(113.%)株MRSA既未檢出(3005±5)m/z信號峰也未檢出(3035±5)m/z信號峰，spa分型中t062、t437、t899、t015、t071和t8660、未知分型分別為3株、2株、2株、其他各1株。

圖3 未檢出δ-毒素質譜圖Fig.3 The spectrum of the δ-toxin negative

表1 HA-MRSA與CA-MRSA δ-毒素質譜峰差異Tab.1 Differences in mass spectrometry between HA-MRSA and CA-MRSA δ-toxin

表2 主要spa分型δ-毒素質譜峰差異Tab.2 Differences in the mass spectrum of δ-toxin from the main spa type

2.3 (3035±5)m/z信號峰與spa t437型的關系

(3035±5)m/z為HldG10S的信號峰，本研究33株spat437型共31株檢出(3035±5)m/z(圖4)，50株其他spa分型中，只有兩株檢出spat8660，檢出(3035±5)m/z，使用儀器配套的做clinProTools 3.0軟件做ROC曲線，曲線下面積0.89，P=0(圖5)。

圖4 spa t437與其他分型δ-毒素比較Fig.4 The differences in δ-toxin between spa t437 and other subtypes

圖5 spa t437特異性質譜峰(3035±5)m/z ROC曲線圖Fig.5 The ROC curve of spa t437 specific MS peak (3035±5)m/z

2.4 未產生δ-毒素的菌株特征

MALDI-TOF MS檢測共有11株MRSA未檢出δ-毒素，均為HA-MRSA，SCCmec分型Ⅰ型1株，Ⅱ型2株，Ⅲ型8株；臨床標本類型，有6株分離自骨關節標本，3株分離自呼吸道標本，1株分離自慢性潰瘍的分泌物標本，1株分離自血液(表3)。

在血瓊脂平板上生長特點，5株為正常的菌落形態及溶血特征，3株分離菌在血瓊脂平板上為小菌落、溶血正常，2株分離菌在血瓊脂平板上為小菌落且48h無明顯溶血環，1株菌落大小正常但48h無明顯溶血環。

3 討論

MALDI-TOF MS技術通過分析待檢菌蛋白質指紋圖譜并與數據庫中的質譜比較，對細菌進行分類鑒定，是目前為此最為有效的細菌鑒定方法[12]，同時還能解決毒力因子測定、耐藥標志物及菌種分型等臨床相關問題[13]。

Gagnaire研究顯示MALDI-TOF MS使用常規方法即可以快速檢測金黃色葡萄球菌的δ-毒素，其質譜峰為(3005±5)m/z和(3035±5)m/z兩種[6]。該毒力因子屬于金黃色葡萄球菌核心基因組編碼的毒力，對中性粒細胞和紅細胞有溶解能力，但不如a-毒素和PSM-a3，動物感染實驗顯示其對疾病進展的作用比PSMα1-PSMα4低[14]，但它可以觸發肥大細胞脫顆粒，因些對皮膚感染和特應性皮炎的發展起顯著作用[15]。而δ-毒素的同基因變異體(HldG10S)的致病性，表現為對細胞溶解作用和趨化作用下降，不引起肥大細胞脫顆粒。但是該變異體的出現有基因型特異性[9]，本研究收集一家醫院6個月分離的83株非重復MRSA，其中33株spat437型的MRSA中共31株檢出HldG10S，ROC曲線下面積為0.89，而spat437型是我國健康人群中攜帶率最高的MRSA克隆[16]，研究發現spat437型的克隆絕大部分屬于ST59型[17-18]， 該克隆是我國南方和鄰近亞洲國家的CA-MRSA最常見的菌株。臨床上CA-MRSA感染多見于無HAMRSA危險因素的患者，如健康兒童、運動員、監獄犯人等，常引起皮膚軟組織感染、骨關節感染和敗血癥等；其更容易攜帶重要毒力殺白細胞素(PVL)[19]， 同時也能促進核心基因組編碼的毒力基因的表達，如PSMα、hla等[20]，動物試驗顯示CA-MRSA具有相當大的逃避中性粒細胞吞噬的能力。近年來國內外相關研究發現有10%～80%的院內感染的患者感染的菌株具有CA-MRSA的分子特征[21-22]，CA-MRSA的菌株已經播散到醫院的環境中引起醫院獲得性相關感染。從流行病學角度HA-MRSA和CA-MRSA雖可采用美國疾病預防控制中心的CA-MRSA定義來初步區分，但在我國，患者的既往就醫史往往不夠完善，為了更精確地調查MRSA的流行特征，基于分子手段的基因分型法(如SCCmec分型、spa分型、MLST分型)使用更為普遍，但這些方法存在操作繁瑣、成本昂貴等不足。本研究采用MALDI-TOF MS檢測MRSA一次性獲得蛋白指紋圖譜，只要通過儀器配套軟件查看是否檢測出(3035±5)m/z這一信號峰，便可快速分辯出毒力更高的CA-MRSA，為及時有效的控制感染，改善患者預后提供病原學依據，這對以spat437型為主要CA-MRSA流行克隆的地區有重要的流行病學意義。

表3 MALDI-TOF未檢出δ-毒素的菌株特征Tab.3 Characteristics of MALDI-TOF δ- toxin negative strains

agr調控系統是金黃色葡萄球菌最重要的調節系統，調控多種毒力因子的表達，RNAⅢ是agr調控系統的主要效應，同時也是δ-毒素的信使RNA。δ-毒素的產生可作為是金黃色葡萄球菌中agr調控系統在營養轉運，氨基酸代謝和其他過程的功能替代標記[20]。通常認為在急性感染中需要的完整性的agr系統功能，而慢性感染agr功能障礙有關[21-22]，使得部分毒力因子的表達量減少或消失。本研究共分析83株臨床分離的MRSA，有11(13.3%)株δ-毒素陰性，而這些菌株均為HA-MRSA，SCCmec分型以Ⅲ型為主，主要為骨關節慢性感染分離菌。這些菌株在體內常形成生物被膜，且對多種抗生素耐藥，在體外培養常表現為小菌落、β-溶血環變小或消失等特性。

綜上所述，MALDI-TOF MS使用常規方法即可快速檢測MRSA的δ-毒素，其質譜峰為(3005±5)m/z和(3035±5)m/z兩種；(3035±5)m/z是δ-毒素的同基因變異體(HldG10S)的質譜峰，使用該信號峰可快速分辯出毒力更高的CA-MRSA，從而為及時有效的控制感染，改善患者預后提供病原學依據；未檢出(3005±5)m/z和(3035±5)m/z兩種質譜峰的菌株是agr調控系統失調的表現，這些菌株不表達δ-毒素，在臨床上與慢性感染有關，體外培養可見小菌落形成、無明顯β-溶血。