銅綠假單胞菌在牛乳中生長的預測

朱 蕾，張愛靜，王鵬杰，夏 凡，董 月，高瑀瓏*

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

假單胞菌是一種能在低溫下生長、可利用多種有機物、分解能力強、可產生氨等腐敗產物的低溫食品腐敗菌。因此，假單胞菌污染乳制品、肉制品、禽蛋類和蔬菜等食品后極易引起腐敗變質，是使這些食品腐敗變質的重要微生物[1]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌中最常見的一個種，又稱綠膿桿菌，廣泛分布于水、空氣、土壤以及人體的呼吸道、皮膚和腸道等處，尤其在潮濕的自然環境中更易生長繁殖，所以其傳播途徑廣泛[2]。銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，可引起人類急性腸道炎、皮膚炎、敗血病和腦膜炎等疾病，其產生的內、外毒素均具有致病性：內毒素能引起系統炎癥反應綜合征，對老人、小孩等抵抗力較弱的群體危害較大；外毒素侵入敏感細胞后，引起哺乳動物蛋白合成受阻，臨床上常引起繼發性感染[3-4]。2014年之前，在食品衛生監測工作中對銅綠假單胞菌監控較少，與其食物中毒相關的報道也較少，但由于其對抗生素等化學治療劑有較強的抵抗性[5]且分布廣，在食品中污染機會較多，有報道建議將其列入食物中毒致病菌目錄[6]。2003年，黃美子等[7]報道了食用新鮮豬肉后出現腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀的案例，經衛生防疫部門鑒定是由銅綠假單胞菌引起的。2010年，沈瑛等[8]也報道了銅綠假單胞菌引起食物中毒的事件。2014年，我國對瓶裝飲用水等衛生檢測標準進行了修訂，增加了對銅綠假單胞菌的監測檢驗，并將其確認為食源性和水源性致病菌。

隨著人們對食品安全的重視，食品微生物安全預測逐漸成為人們關注的熱點[9]。食品微生物預測學是一門基于微生物學、應用計算機學、工程數學及統計學等的綜合學科。微生物預測模型的建立有利于對食品在貯藏、運輸和銷售期間微生物變化的監測，了解其存活信息[10]，為食品微生物安全控制提供科學的理論依據[11]。微生物生長預測模型主要有一級模型和二級模型。一級模型描述微生物數量對時間的響應，常見的一級模型有Linear模型、Logistic模型[12]和Gompertz模型[13]等。Linear模型的操作簡便，但預測數據的精確度不高；Logistic模型在數學上是用于描述一個普通笛卡爾平面上的S形曲線，有人用其研究細菌生長曲線，但其不能完整顯示S形曲線，是一個無滯后期的S形曲線[12]；而Gompertz模型克服了這些缺點，在目前應用較多[9]。Gompertz模型能夠較好地用于研究單細胞微生物生長的典型生長曲線，在研究細菌生長的延滯期、指數期和穩定期時，分別用延滯時間（λ）、最大比生長速率（μmax）、最大菌落數（b）來描述這3 個階段的特征。在食品貯藏期間：λ可用于分析食品貨架期的參數，表示食品安全貯存時間的長短；μmax是微生物生長動力學參數，表示食品腐敗變質的速率；b表示在腐敗變質的食品中微生物的最大生長量。目前，國內外對一些食品基質中微生物生長模型的建立已有一些報道，但是對于銅綠假單胞菌在食品中預測模型的研究鮮有報道。鄒宇等[14]運用Gompertz模型、Logistic模型建立了在低溫下牛乳中李斯特氏菌的生長模型，發現Gompertz模型為李斯特氏菌在牛乳中生長的最適模型；M?ller等[15]在新鮮牛肉中建立了沙門氏菌的生長模型；Lee等[13]用Gompertz模型和Logistic模型擬合了生豬肉中李斯特氏菌的生長曲線。目前，用來研究微生物生長常用的二級模型有修正Ratkowsky模型[16-17]、二次多項數學模型[18]、Arrhenius模型[9,19]。二次多項數學模型研究多種因素對微生物生長的影響，其中的參數沒有明確的物理意義；Arrhenius模型最初是用來表征化學反應中反應速率與溫度之間的關系，有人曾把它引入微生物預測模型中，但因誤差較大，目前應用較少；通常采用修正Ratkowsky模型研究溫度對微生物生長速率的影響。目前，對于新增的食源致病性銅綠假單胞菌在食品中安全預測的研究鮮見報道。本研究基于Gompertz模型、修正Ratkowsky模型、Hyperbola模型[20]研究銅綠假單胞菌6～48 ℃的生長情況和生長溫度對銅綠假單胞菌μmax與λ的影響；將μmax與λ的乘積定義為菌體細胞的初始生理狀態參數（h0），研究生長溫度對h0的影響；建立牛乳中銅綠假單胞菌生長的一級預測模型和生長溫度對μmax、λ影響的二級模型，為牛乳的安全貯藏及控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853購自北京微生物研究所，采用胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養基培養。供試菌經活化后，接入TSB液體培養基，于37 ℃、140 r/min振蕩培養48 h，備用。

TSB培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養基 南京丁貝生物科技有限公司；超高溫滅菌全脂牛乳 南京市仙林大學城蘇果超市；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSC-1300IIA2型生物安全柜 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；Scan1200型自動影像分析菌落計數儀法國Intersicence公司；UV-9100型紫外分光光度計美國Beckman公司；ZQTY-70S型大容量低溫搖床 上海知楚儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；101-3AS電熱鼓風干燥箱 上海蘇進儀器設備廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養箱 上海三發科學儀器有限公司；SX-500高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；精密電子天平 北京塞多利斯天平有限公司；BCD-196T型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同溫度下銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的平板菌落計數

將按1.1節方法制備的ATCC27853菌懸液按體積分數1%接種于超高溫滅菌全脂牛乳和TSB培養基（對照組）中，使初始菌落數在102～103CFU/mL范圍內，分別置于6、10、16、22、28、36、42、45、48、50 ℃下140 r/min振蕩培養，每個溫度在不同時間點取樣，并在TSA平板上進行菌落計數。時間間隔的選取根據預實驗組TSB培養基上ATCC27853的生長情況決定，ATCC27853的生長情況通過紫外分光光度計測定的吸光度來測定，采用平板菌落記數法進行菌落計數[21]，檢測限為1 CFU/mL。牛乳中ATCC27853的生長量表示為每毫升牛乳中活菌數量的對數。

1.3.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的一級Gompertz模型的建立

擬合ATCC27853在6、10、16、22、28、36、42、45、48 ℃下的生長曲線，建立ATCC27853在牛乳中生長的一級Gompertz模型，如式（1）所示。

式中：Nt表示在某時間（t/h）時ATCC27853菌落數的對數（lg（CFU/mL））；a表示t＝0 h時ATCC27853菌落數的對數（lg（CFU/mL））；b表示ATCC27853最大菌落數的對數（lg（CFU/mL））；d表示達到最大生長速率時所用的時間（即生長曲線的拐點）/h；c表示ATCC27853在d時刻的最大生長速率/h-1。

細菌的μmax和λ是用來描述其生長的兩個關鍵參數。ATCC27853的μmax、λ與Gompertz模型的相關參數之間的關系分別見式（2）、（3）[22]。

式中：e為自然常數（2.718 28）。

將式（2）、（3）式代入式（1）中，則Gompertz模型可轉化為式（4）。

式中：N0表示t＝0 h時ATCC27853初始菌落數的對數（lg（CFU/mL））；Nmax表示ATCC27853最大菌落數的對數（lg（CFU/mL））。

微生物生長的λ是指微生物接種到新鮮培養液后的一段時間內，因代謝系統適應新環境的需要，使得核糖體、酶類和ATP等的合成加速、RNA含量增加、新的細胞成分被合成，從而導致細胞體積變大，但這一階段細胞數目沒有增加。本研究將這一階段的這種生理、代謝狀態稱為細胞的初始生理狀態，用h0來表示[13]，用來描述細胞適應新環境的能力，h0與λ和μmax的關系見式（5）[23]。

1.3.3 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的二級修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型的建立

在一級模型的基礎上建立二級模型，研究生長溫度對一級模型參數的影響。利用修正Ratkowsky模型研究μmax與溫度的關系，如式（6）所示。

式中：μmax表示在溫度T/℃下的最大比生長速率/h-1；Tmin表示ATCC27853生長代謝活力為零時的最低溫度/℃；Tmax表示ATCC27853生長代謝活力為零時的最高溫度/℃；m/（℃-1·h-0.5）、n/℃-1為常數。

基于Hyperbola模型，將ATCC27853的λ取自然對數轉化成ln λ，研究λ和T之間的關系，如式（7）所示。

式中：T1表示ATCC27853的最低生長溫度/℃；T2表示當生長溫度大于最低生長溫度時，λ減少的時間所對應的溫度的升高量/℃。

1.3.4 模型的評價及其驗證

采用Matlab 2016b軟件對實驗數據分別進行Gompertz模型、修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型的建立。模型的評價采用決定系數（R2）、均方根誤差（RMSE）、準確因子（Af）和偏差因子（Bf）。其中，R2和RMSE表示模型的精確度、可靠性，R2越接近于1，RMSE越小，模型擬合度越高[24-25]。Af用于衡量預測值與觀測值之間的接近程度：Af越接近于1表示模型的擬合度越高，Af越小表明模型預測值與實測值越接近，模型越精確。Bf＞1表示模型預測值比實測值高，Bf＜1表示模型預測值比實測值低，Bf越接近1表示模型擬合度越高[26]。

模型的驗證采用R2、Af和Bf。一級模型的驗證：使ATCC27853在6、10、16、22、28、36、42、45、48 ℃下生長，每個生長溫度取不同于模型建立的時間點進行取樣驗證。二級模型的驗證：在ATCC27853不同的生長溫度12、19、25、39、44 ℃進行取樣，每次實驗重復3 次。R2、RMSE、Af和Bf的計算見式（8）～（11）。

式中：n表示測定值的個數。

1.4 數據統計與分析

數據處理及作圖通過Matlab 2016b軟件，用Gompertz模型擬合銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下的生長曲線，用修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型分別擬合牛乳中ATCC27853的生長溫度對μmax和λ之間的二級模型，計算各個參數值并進行多重比較，結果以表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中一級Gompertz模型的建立

圖1 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中的Gompertz模型曲線以及失活情況Fig. 1 Gompertz growth curves for P. aeruginosa ATCC27853 in milk and inactivation

由圖1可以看出，除50 ℃外，其余溫度的實測值皆比較均勻地分布于預測生長曲線的兩側，說明利用Gompertz模型能較好地擬合ATCC27853在牛乳中6～48 ℃的生長曲線，從低到高這9 個溫度下，ATCC27853在牛乳中的生長曲線基本均呈現S形，有延滯期、對數期、穩定期3 個部分。在低溫度下λ較為明顯，如在10 ℃下λ約為25 h；當生長溫度超過28 ℃后，λ就變得很短，如在28、36、42 ℃下，僅用約1 h就能進入對數生長期，菌體能很快適應新的環境。進入對數期后，不同生長溫度下ATCC27853對數期差異明顯，如6 ℃時對數期約100 h，而36 ℃時只需約10 h，表明ATCC27853在不同溫度下的生長速率不同。進入穩定期后，在10～42 ℃下，菌體最大生長量為9.25～9.78（lg（CFU/mL）），差異不明顯。在6、45、48 ℃下的菌體最大生長量明顯降低。ATCC27853在50 ℃時隨著時間的延長菌落數降低，到14 h后低于檢測限，說明ATCC27853在50 ℃時不生長，已經失活。綜上，生長溫度是ATCC27853在牛乳中生長繁殖的關鍵因素。

由表1可以看出，9 個溫度下a在2.65～3.60（lg（CFU/mL））之間，相差小于1（lg（CFU/mL））。在10～42 ℃時，ATCC27853的b均可達到109CFU/mL，表明在10～42 ℃時ATCC27853所能達到的最大菌落數并不隨溫度的變化而變化。當溫度為6、45、48 ℃時，ATCC27853的b分別為7.78、8.85、7.77（lg（CFU/mL）），與10～42 ℃時相比差異顯著（P＜0.05），菌體的生長受到明顯的抑制。6～48 ℃時，c隨溫度的升高先增大后減小，36 ℃時c最大。d隨溫度的升高呈先縮短再延長的趨勢，從172.95 h縮短到4.77 h再延長到25.60 h，36 ℃時d最短。

表1 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中于不同溫度下生長的一級Gompertz模型參數值Table 1 Estimated parameter values in Gompertz growth curves for P. aeruginosa ATCC27853 in milk at different temperatures

在6～36 ℃的生長溫度范圍內，μmax由0.017 8增長到0.641 3，因為隨著溫度的升高，ATCC27853的代謝反應及生長速率在加快，最適生長溫度36 ℃也是該菌生長速率最快的溫度；當生長溫度為48 ℃時，μmax顯著降低到0.190 6（P＜0.05）。生長溫度上升到50 ℃時，可能是因為ATCC27853菌體內的核酸、蛋白質、細胞膜等熱敏性大分子物質在高溫下發生變性，細胞的生理代謝功能急劇下降，菌體死亡；對應的λ也發生相應的變化，從86.88 h縮短到1.41 h，之后又延長到15.71 h，ATCC27853在最適生長溫度36 ℃時λ最短。牛乳在貯藏期間，一旦由微生物引起腐敗變質，微生物的λ與其貨架期有關，λ越長貨架期越長；在較低溫度和較高溫度下微生物的λ較長，會延長牛乳的貨架期。ATCC27853細胞的h0描述了細胞適應新環境的能力，h0越高細胞適應環境的能力越弱。由表1可以看出，溫度為6、10、48 ℃時的h0比較高；16～45 ℃時h0基本保持不變，且差異不顯著（P＞0.05）。此外，50 ℃與6～48 ℃菌體的初始菌落數基本相同，50 ℃下，隨著培養時間的延長，ATCC27853菌體細胞不能忍受此高溫，數量呈下降趨勢，并于14 h后低于檢測線，表明ATCC27853菌體死亡。

員工當月工資薪金所得低于稅法規定的費用扣除額，適用公式：應納稅額＝（員工當月取得全年一次性獎金－員工當月工資薪金所得與費用扣除額的差額）×適用稅率－速算扣除數。

2.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中一級Gompertz模型的評價

由表2可知，在6～4 8 ℃時，模型的RMSE≤0.219 2，R2≥0.991 9，說明模型擬合效果較好。Af和Bf皆接近于1，也表明該模型的擬合度較好，ATCC27853的一級Gompertz模型的預測值與實測值之間偏差很小，基本沒有系統偏差，不會產生安全性危害的情況。Ross等[27]認為Bf在0.90～1.05的范圍內時模型擬合好；Bf在0.70～0.90與1.06～1.15之間模型擬合效果可以接受；Bf＜0.70或Bf＞1.15時，存在系統偏差，模型擬合不可接受。綜上，本研究建立的一級Gompertz模型能很好地預測ATCC27853在牛乳中6～48 ℃下的生長，擬合效果好，且有效、可靠。

表2 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的Gompertz模型的評價結果Table 2 Fitness evaluation of Gompertz model for P. aeruginosa ATCC27853 growth in milk

2.3 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中一級Gompertz模型的驗證

利用Matlab軟件對表3中實測值及一級模型的預測值進行相關性分析，R2＝0.993 6，Af＝1.018 2，Bf＝0.999 6，也表明Gompertz模型的有效性，可以利用Gompertz模型對牛乳中的ATCC27853生長進行預測。

表3 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的Gompertz模型的驗證Table 3 Validation of Gompertz model for P. aeruginosa ATCC27853 growth in milk

2.4 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長二級模型的建立

圖2 牛乳中銅綠假單胞菌ATCC27853生長溫度對μmax的影響Fig. 2 Effect of growth temperature on the maximum specific growth rate of P. aeruginosa ATCC27853 in milk

為了進一步了解溫度對牛乳中ATCC27853生長速率的影響，基于2.1節建立的一級Gompertz模型，利用修正Ratkowsky模型研究生長溫度對μmax的影響。由圖2可知，隨著溫度的升高，ATCC27853的μmax逐漸增加，直至最適生長溫度36 ℃；當溫度超過36 ℃后μmax開始下降直至為零。微生物生長的λ是指微生物接種到新鮮培養液后，最初一段時間要適應新環境，一時還缺乏分解或催化有關底物的酶或者足夠的中間代謝物，其細胞數目不會發生變化，但對于不同的生長溫度這個適應期是不相同的。由圖3可知，隨著生長溫度的升高，ATCC27853的λ逐漸縮短，lnλ縮短，說明隨著生長溫度的升高，ATCC27853細胞的代謝系統適應溫度變化的時間在縮短。但是，當溫度升到48 ℃后，λ明顯延長，Hyperbola模型不再適合擬合生長溫度與lnλ的關系。

圖3 牛乳中銅綠假單胞菌ATCC27853生長溫度對λ的影響Fig. 3 Effect of growth temperature on the lag phase duration of P. aeruginosa ATCC27853 in milk

表4 二級模型參數的估計值和95%置信區間值Table 4 Estimates and 95% confidence level of parameters in secondary model

如表4所示，TCC27853的修正Ratkowsky模型中Tmin為1.8 ℃，Tmax為48.8 ℃，可為該菌在牛乳中的安全控制提供理論依據。ATCC27853的Hyperbola模型中T1為0.7 ℃，是ATCC27853的生長最低溫度；參數Tmin和T1皆表示理論最低生長溫度，實驗表明ATCC27853在4 ℃下不生長（實驗數據未顯示），修正Ratkowsky模型中最低溫度的理論值與實際值更接近，而Hyperbola模型擬合的最低溫度略低于實際情況；利用Hyperbola模型，能夠快速預測牛乳的安全貯存時間，確定其貨架期。

2.5 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長二級模型的評價

修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型的評價結果為：RMSE≤0.256 7，R2≥0.974 1，1.087 0≤Af≤1.152 0，1.052 8≤Bf≤1.0721，R2、Af和Bf皆接近于1，說明二級模型擬合度較好。

2.6 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長二級模型的驗證

表5 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的二級模型的驗證結果Table 5 Validation of secondary models for P. aeruginosa ATCC27853 growth in milk

如表5所示，利用Matlab軟件將實驗所得μmax的實測值與修正Ratkowsky模型的預測值進行相關性分析，R2＝0.996 5，Af＝1.052 8，Bf＝1.021 2。對lnλ的實測值與Hyperbola模型預測值的相關性進行分析，R2＝0.992 5，Af＝1.058 1，Bf＝0.988 5。表明本研究所建立的二級修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型是有效且可靠的。

3 討 論

牛乳的營養價值較高，在加工、運輸、貯藏和銷售的過程中微生物對其污染是很難避免的，極易因污染銅綠假單胞菌而引起腐敗變質。本研究建立了6～48 ℃下ATCC27853在牛乳中生長的一級和二級模型，發現ATCC27853能在6 ℃的低溫下生長，最高生長溫度為48 ℃；研究了牛乳中溫度對ATCC27853生長的影響及預測，為其安全貯藏及控制提供理論依據。

本研究首先利用Gompertz模型建立了ATCC27853的一級生長模型，基于一級生長模型的參數，再結合修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型，分別建立了ATCC27853的μmax、λ與生長溫度之間的二級模型。發現修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型能分別較好地建立ATCC27853在牛乳中生長溫度與μmax、生長溫度與λ的關系。

由h0可以確定ATCC27853的初始生理狀態[25]。Baranyi[28]、Gospavic[23]和Velugoti[29]等的研究認為不同溫度下菌體細胞的h0基本保持恒定。Mellefont等[30]在研究生長溫度對大腸桿菌和克雷伯氏菌的影響時發現，h0不是恒定不變的，溫度的變化還會影響λ；Delignette-Muller等[31]的研究發現，單增李斯特氏菌接種前的培養溫度與接種后生長溫度的變化幅度與h0有一定的相關性；Xanthiakos等[25]研究了1.5～16 ℃下單增李斯特氏菌的生長情況，發現在1.5～8.0 ℃下h0明顯高于在8～16 ℃。

在ATCC27853的初始菌量基本相同的情況下，本研究發現在16～45 ℃的范圍內，牛乳中ATCC27853菌體h0基本保持恒定，隨溫度變化h0變化不顯著（P＞0.05），這與Gospavic等[23]的研究結果一致；在6 ℃和10 ℃時，h0明顯高于16～45 ℃，此結果與Xanthiakos等[25]的研究結果相似，原因可能是低溫（6 ℃和10 ℃）限制了菌體細胞內核酸、蛋白質和細胞膜等大分子物質的合成。

Baranyi等[28]的研究認為h0＝μmax×λ、α0＝exp（-h0）。當ATCC27853的生長溫度在16 ℃時h0＝1.017 9（表1），則α0＝36.14%，表明在此溫度下ATCC27853菌體細胞的比生長速率為μmax的36.14%；在16～45 ℃時α0平均值約為40.11%，6、10、48 ℃時α0分別為21.22%、23.91%和5.01%，可以看出6、10、48 ℃的α0明顯低于16～45 ℃。生長溫度為6、10、48 ℃時生長速率明顯較低，推測可能是ATCC27853接種前的培養溫度（36 ℃）與被接種后的生長溫度（6、10、48 ℃）之間存在較大的差異，導致h0較大的改變，生長溫度對初始生理狀態的影響為預測微生物生長研究提供理論依據。

綜上，本研究采用Gompertz模型建立了6～48 ℃下牛乳中銅綠假單胞菌ATCC27853的一級生長模型，結合修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型分別建立了ATCC27853的生長溫度對其μmax和λ影響的二級模型；用R2、RMSE、Af和Bf評價模型擬合并驗證模型的有效性和可靠性，結果表明：用Gompertz模型、修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型建立的一級生長模型和二級模型擬合度高；ATCC27853的生長溫度對h0的影響表明菌株培養溫度（36 ℃）與被接種后的生長溫度（6、10、48 ℃）之間存在較大的差異時會導致h0發生較大的改變。ATCC27853生長溫度對μmax、λ和h0影響的預測模型的建立為其在牛乳中的安全控制提供理論依據。