拉曼光譜分析牛肉貯藏過程中肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的變化

張同剛，羅瑞明，李亞蕾*，馬夢(mèng)斌，周亞玲

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

肉色是肉品外觀評(píng)定的重要指標(biāo)，直接影響市場(chǎng)上消費(fèi)者的購(gòu)買欲望[1]。屠宰后肉的顏色與肌紅蛋白的氧化狀態(tài)有關(guān)[2-3]。在貯藏過程中，受低溫、低氧、結(jié)合水脫離及細(xì)胞液濃縮、次級(jí)鍵新生和斷裂等因素影響，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集和氨基酸多肽鏈逐漸展開，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)逐漸喪失生物活性[3-8]。隨著牛肉貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌紅蛋白化學(xué)與物理性質(zhì)均發(fā)生一定的變化，如表面疏水能力、二硫鍵構(gòu)型含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。現(xiàn)階段對(duì)于肌紅蛋白的研究，主要集中在物理化學(xué)性質(zhì)變化方面，較少涉及到微觀分子結(jié)構(gòu)水平。為了進(jìn)一步探索肉色變化規(guī)律，有必要了解貯藏過程中肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。

拉曼光譜提供樣品分子的轉(zhuǎn)動(dòng)或振動(dòng)信息[9-12]。與其他光譜技術(shù)相比，拉曼光譜技術(shù)樣品不需要預(yù)處理，具有快速、無損檢測(cè)、樣品量少等特點(diǎn)[13]，該技術(shù)通過反射氨基酸或者肽鏈的不同種振動(dòng)模式得到響應(yīng)信號(hào)，能提供包含蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息的光譜信息圖。作為一種新興的研究手段，拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用到監(jiān)控肉類蛋白（如肌球蛋白）結(jié)構(gòu)變化[14-17]。本實(shí)驗(yàn)采用拉曼光譜技術(shù)，研究牛肉肌紅蛋白特征峰區(qū)帶圖譜，對(duì)肌紅蛋白氧化還原狀態(tài)進(jìn)行歸屬指認(rèn)，解析肌紅蛋白結(jié)構(gòu)變化信息，從蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)層面揭示牛肉貯藏過程中色澤變化的微觀機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用寧夏本地1.5～2 歲齡左右肉牛（秦川牛）的牛背最長(zhǎng)肌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，樣品購(gòu)自寧夏回族自治區(qū)銀川市西夏區(qū)新百超市。

硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氯化鈉（均為分析純） 銀川昕泰生物試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Inspector 300拉曼光譜儀 美國(guó)賽普斯公司；HH.SY21-Ni6-C高速組織搗碎機(jī) 江蘇金壇市億通電子有限公司；UV-1200紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取牛背最長(zhǎng)肌后，立即真空包裝，在4 ℃左右避光貯藏，在貯藏的21 d過程中，每3 d取一次樣進(jìn)行測(cè)定，以胴體修整作為第0天。

1.3.2 肌紅蛋白的提取及含量測(cè)定

參考Thiansilakul等[18]的方法，并稍作修改，取牛背最長(zhǎng)肌，去除表面筋膜及結(jié)締組織，切碎。準(zhǔn)確稱取10 g肉樣，加入1 000 mL提取緩沖劑（0.01 mol/L Tris-HCl，pH 6.4，4 ℃），10 000 r/min勻漿1 min，離心（9 600×g、10 min，4 ℃），濾紙過濾，得濾液。濾液中加入固體硫酸銨，一邊加一邊攪拌，至飽和度達(dá)到50%。在4 ℃下靜置3 h，10 000×g離心15 min（4 ℃），去除沉淀，上清液中繼續(xù)加入硫酸銨（選用硫酸銨沉淀是因?yàn)榕c其他中性鹽相比，硫酸銨溫度系數(shù)小但溶解度大，不會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)以引起蛋白變性，且分級(jí)沉淀效果佳），邊加邊攪拌，至不再溶解，在4 ℃下靜置3 h，10 000×g下離心15 min（4 ℃）。將沉淀溶解于5×10-3mol/L Tris-HCl起始液中，裝入透析袋（10 000 COMW），于4 ℃上述提取緩沖劑中透析，每6 h換一次透析液，共換5 次。

選用DEAE-Sepharose FF層析柱，梯度洗脫液為0.01 mol/L pH 8.6的Tris-HCl緩沖液與200 mmol/L NaCl的混合溶液，每4 min收集一管洗脫液（粗肌紅蛋白），采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定洗脫液分別在542 nm與700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。樣品中肌紅蛋白含量按下式進(jìn)行計(jì)算。

肌紅蛋白含量/（mg/g）=（A542nm-A700nm）×2.303

1.3.3 拉曼光譜測(cè)定

將待測(cè)樣品置于拉曼光譜儀50 倍鏡頭下，調(diào)整好鏡頭與樣品間的距離后，開始掃描，激光固定波長(zhǎng)為785 nm，功率為10 mW，掃描范圍為200～2 500 cm-1，聚焦深度為200 μm。每個(gè)樣品5 個(gè)平行樣，每個(gè)樣重復(fù)3 次。拉曼光譜數(shù)據(jù)選取SGS平滑濾波方法為光譜預(yù)處理法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行處理，采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，采用Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，其中P＜0.05表示差異顯著。通過PeakFit 4.0軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行峰分離和曲線擬合，數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉貯藏期間肌紅蛋白拉曼光譜

圖1 牛肉貯藏期間的拉曼光譜Fig. 1 Original Raman spectra of beef samples under different storage time

圖1為不同貯藏時(shí)間的牛肉樣品的拉曼光譜曲線。1996年，Li-Chan等已初步指認(rèn)特定波數(shù)的肌紅蛋白拉曼光譜的特征峰[19]。肌紅蛋白的主要結(jié)構(gòu)是由拉曼光譜中酰胺Ⅰ、Ⅲ帶的特征峰強(qiáng)度與位移所表現(xiàn)出來的，其中酰胺Ⅰ帶來自于C—N與C＝O鍵的振動(dòng)，酰胺III帶來自于N—H在平面上的轉(zhuǎn)折和C—N鍵的振動(dòng)[20-24]。采用Labspec 4.0軟件對(duì)牛肉樣品中肌紅蛋白的酰胺I帶峰強(qiáng)進(jìn)行分析，可得：1 645～1 660 cm-1處峰表示α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 665～1 680 cm-1處峰表示β-折疊結(jié)構(gòu)；1 680～1 690 cm-1處峰表示β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；1 660～1 670 cm-1處峰表示無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。

通常拉曼光譜峰強(qiáng)度與樣品的化學(xué)鍵或基團(tuán)數(shù)目具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。峰強(qiáng)度可以直接反映樣品化學(xué)鍵或基團(tuán)變化程度，當(dāng)樣品的拉曼光譜曲線發(fā)生位移時(shí)，表明樣品受內(nèi)外部因素影響，導(dǎo)致其所對(duì)應(yīng)的化學(xué)鍵或基團(tuán)發(fā)生了變化。

2.2 貯藏時(shí)間對(duì)牛肉樣品肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖2 牛肉樣品貯藏過程中肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Fig. 2 Secondary structure composition of myoglobin in beef

由圖2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，β-折疊含量則呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，無規(guī)卷曲含量呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。高瑞昌等[25]采用拉曼光譜技術(shù)測(cè)定了凍藏過程中對(duì)蝦肌動(dòng)球蛋白的變化，得出南美白對(duì)蝦肌肉蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)側(cè)鏈構(gòu)象在凍藏過程中的變化，主要由組成肌動(dòng)球蛋白的氨基酸相互間的分子作用造成的。李可等[26]研究了NaCl對(duì)豬肉蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響，得出NaCl會(huì)使豬肉蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊含量變化顯著。說明隨所處微環(huán)境的變化，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量也隨之變化。

表1 酪氨酸的費(fèi)米共振I850/I830以及殘基暴露/包埋分子數(shù)Table 1 Tyr I850/I830 Fermi doublet intensity ratio and number of exposed/buried amino acid residues

850 cm-1與830 cm-1附近的拉曼光譜特征峰（酪氨酸的費(fèi)米共振）隨微環(huán)境變化而改變，當(dāng)強(qiáng)度比I850/I830≥1（I850、I830分別表示850、830 cm-1處峰的歸一化強(qiáng)度）時(shí)，該酪氨酸是“暴露的”；I850/I830＜1時(shí)，該酪氨酸就是“埋藏的”[27]。本研究中I850/I830在0.81～1.20之間，包埋和暴露的兩種氨酸殘基的分子數(shù)（N包、N暴）隨貯藏時(shí)間的變化見表1。

酪氨酸殘基通常存在于蛋白分子的表面，呈暴露狀態(tài)，以氫鍵受體或供體的形式與H2O結(jié)合。由表1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，N包/N暴和酪氨酸I850/I830均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。

2.3 二硫鍵分析

500～550 cm-1附近的拉曼光譜屬于二硫鍵特征譜帶。在此范圍的波段內(nèi)振動(dòng)模式與波數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：500～510 cm-1處為gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm-1處為gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，535～545 cm-1處為trans-gauche-trans（t-g-t）模式[28-32]。采用Peak Analyzer 4.0軟件對(duì)肌紅蛋白進(jìn)行多峰值Guassina擬合，分析貯藏時(shí)間對(duì)肌紅蛋白中二硫鍵構(gòu)型與含量變化的影響。肌紅蛋白的二硫鍵構(gòu)型主要為t-g-t模式，樣品中二硫鍵構(gòu)型組成與含量變化見表2。

表2 二硫鍵構(gòu)型組成及含量Table 2 Configurational composition of disulfide bonds in myoglobin

肌紅蛋白氧化狀態(tài)與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、酪氨酸與色氨酸殘基暴露出的數(shù)量有很強(qiáng)的相關(guān)性，貯藏過程中肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)逐漸疏散無序，氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變。其中t-g-t與g-g-g構(gòu)型分別屬于分子間、內(nèi)的二硫鍵構(gòu)型。由表2可得，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌紅蛋白二硫鍵t-g-t構(gòu)型含量逐漸降低，說明肌紅蛋白分子間的部分二硫鍵受到破壞，從而導(dǎo)致其分子間的作用力降低，肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與功能下降。

2.4 貯藏過程中肌紅蛋白氧化狀態(tài)與拉曼光譜相關(guān)數(shù)據(jù)的相關(guān)關(guān)系

由表3可知，氧合肌紅蛋白與高鐵肌紅蛋白含量、I760分別呈極顯著、顯著負(fù)相關(guān)，r分別為-0.95、-0.73，與α-螺旋含量呈極顯著正相關(guān)（r＝0.88）。高鐵肌紅蛋白含量與I760（r＝0.89）、I850/830（r＝0.85）、α-螺旋含量（r＝0.83）、β-轉(zhuǎn)角含量（r＝0.86）呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，與β-折疊含量呈現(xiàn)顯著相關(guān)（r＝0.71）。I760與I850/830（r＝0.91）、β-折疊含量（r＝0.86）呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，與α-螺旋含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.74）。I850/830與α-螺旋含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.93）。α-螺旋含量與β-折疊含量（r＝-0.87）、β-轉(zhuǎn)角含量（r＝-0.79）、無規(guī)卷曲含量（r＝-0.81）呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)。β-折疊含量與β-轉(zhuǎn)角含量（r＝0.82）、無規(guī)卷曲含量（r＝0.90）呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。β-轉(zhuǎn)角含量與無規(guī)卷曲含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（r＝0.76）。因此可以看出，肌紅蛋白氧化狀態(tài)與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、酪氨酸與色氨酸殘基暴露數(shù)量有很強(qiáng)的相關(guān)性，并由此對(duì)肉色及其穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

表3 貯藏過程中肌紅蛋白氧化狀態(tài)與拉曼光譜相關(guān)數(shù)據(jù)的相關(guān)關(guān)系Table 3 Correlation between myoglobin oxidation states and Raman spectral data during beef storage

3 結(jié) 論

通過對(duì)貯藏期間牛肉肌紅蛋白拉曼光譜分析可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量逐漸降低，無規(guī)卷曲含量則逐漸上升，β-折疊含量先升高后下降，β-轉(zhuǎn)角含量先下降后上升；肌紅蛋白中的二硫鍵主要以t-g-t構(gòu)型為主，二硫鍵變化的同時(shí)，會(huì)使肌紅蛋白中的血紅素輔基八面體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響氧與肌紅蛋白的結(jié)合能力，使氧合肌紅蛋白氧化成為高鐵肌紅蛋白；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋轉(zhuǎn)化成β-折疊或無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)時(shí)，蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生分子重排，新產(chǎn)生的分子構(gòu)象相對(duì)于原始具有活性的蛋白分子以“錯(cuò)誤”方式存在，造成肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)原始構(gòu)象發(fā)生改變，最終導(dǎo)致肌紅蛋白作為色素蛋白的特有功能下降乃至喪失。因此，在牛肉貯藏過程中，由于肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的改變，肉色穩(wěn)定性下降并發(fā)生劣變。本實(shí)驗(yàn)從蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)層面，揭示了貯藏期間牛肉色澤變化的微觀機(jī)理。