無核白葡萄干制過程中酚類物質的變化及其與褐變的關系

李曉麗，陳計巒，范盈盈，何偉忠，王 智，劉峰娟,*

（1.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊），新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農產品質量安全重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091；4.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

目前，新疆吐魯番地區已成為中國最大的葡萄干加工生產基地，該地區的綠葡萄干已成為中國葡萄干的特色產品并享譽全球[1]。生產綠葡萄干的主要葡萄品種為無核白葡萄，而無核白葡萄在脫水干制過程中極易發生褐變，嚴重影響了葡萄干的品質[2-3]。因此，干制褐變已成為制約無核白葡萄干產業持續健康發展的關鍵問題[4-5]。

褐變是果蔬及其制品在加工和貯藏的過程中，在內、外因素的綜合作用下表面顏色發生改變的現象[6]。大多數研究認為果蔬加工和貯藏過程中的褐變主要是酶促褐變[7-8]。酶促褐變是在氧氣存在的條件下多酚氧化酶催化酚類物質向醌及其聚合物轉變的過程，反應生成褐色素或黑色素，造成褐變現象[9-10]。無核白葡萄采后脫水干制過程中的褐變主要為酶促褐變[11-12]。酶促褐變的三大關鍵因素之一即為酚類物質，目前關于葡萄中酚類物質的研究主要集中在葡萄成熟過程及釀造過程中酚類物質種類和含量的變化[13-14]、不同品種和不同產區葡萄中酚類物質組成及其與抗氧化活性的關系等方面[15-17]。對于干制過程中葡萄酚類物質種類和含量的變化及其與褐變的關系的研究還相對較少。無核白葡萄采后干制過程中，在很長一段時間內仍然保持著生命活力，對脫水脅迫仍能做出一定的反應，也會通過一系列代謝來適應這種脅迫。而這些改變很可能會對其次生代謝產物——酚類物質產生影響，從而影響褐變的發生。

由于無核白葡萄中主要的酚類物質以及這些酚類物質如何參與酶促褐變等均未明確，為探討其在干制過程中酚類物質的變化，本實驗以無核白葡萄為研究對象，研究脫水干制過程中其酚類物質組成的變化以及主要酚類物質與多酚氧化酶的反應，以期揭示無核白葡萄在采后脫水干制過程中酚類物質的變化及其與褐變的關系，為提高無核白葡萄干品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核白葡萄采自新疆吐魯番市。挑選成熟、無病蟲害、無損傷、大小均勻的果實為實驗材料。葡萄果實可溶性固形物質量分數為19%～22%，濕基水分質量分數為（79.00±0.11）%，果實直徑為（11.17±0.45）mm，長度為（15.25±0.23）mm。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、甲醇、福林-肖卡試劑（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司；槲皮素、鄰羥基苯甲酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、原花青素B2、山柰酚、白藜蘆醇、異鼠李素、蘆丁、兒茶素、阿魏酸、楊梅素、香草酸（均為標準品） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2104N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SK2200H超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司；全能臺式高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾公司；超高效液相色譜-離子淌度飛行時間質譜儀（ultra performance liquid chromatography-ion mobility quadrupole-time of flight mass spectrometer，UPLC-IMQTOF-MS） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將無核白葡萄置于陰涼干燥處，環境平均溫度為25 ℃，平均相對濕度45%，在無核白葡萄脫水質量損失率[18]0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%時取樣，測定各項指標。

1.3.2 無核白葡萄褐變度的測定

取干質量3 g無核白葡萄按料液比1∶10加蒸餾水，勻漿后在4 ℃下9 000 r/min離心30 min，褐變度以上清液在420 nm波長處的吸光度表示[19]。

1.3.3 酚類提取液制備

準確稱取5.00 g不同質量損失率的無核白葡萄，用30 mL酸化甲醇溶液在100 W、25 ℃條件下超聲輔助提取30 min，然后于9 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，重復2 次，合并提取液。

1.3.4 總酚含量的測定

采用福林-肖卡法[20]，以沒食子酸標準溶液建立標準曲線，回歸方程為y＝0.821x+0.070（R2＝0.994 8）。式中：x為沒食子酸質量濃度/（mg/mL）；y為沒食子酸含量/（mg/g）。結果以每克樣品中沒食子酸干質量表示。

1.3.5 酚類物質組成的測定

參照Kolniak-Ostek等[21]的方法，采用UPLC-IMQTOF-MS進行酚類物質單體測定。UPLC條件為：色譜柱采用UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相由溶劑A（體積分數0.1%甲酸）和溶劑B（乙腈）組成。梯度洗脫：0～1 min，99%溶劑A；1～12 min，99%～0%溶劑A；12～13.5 min，0%～99%溶劑A。流速0.45 mL/min，進樣量10 μL，柱溫45 ℃，進樣室溫度10 ℃。質譜條件為：毛細管電壓2 500 V，錐形電壓30 V，離子源溫度100 ℃，去溶劑化溫度300 ℃，脫溶劑氣體（氮氣）流速300 L/h，電壓斜坡循環0.3～2.0 V。對比自建數據庫進行定性分析。

數據庫中酚類物質包括：表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表棓兒茶素、棓兒茶素、兒茶酸沒食子酸酯、原花青素B2、原矢車菊素B2、咖啡酸乙酯、順式-白藜蘆醇、芹菜苷、黃岑苷元、安息香酸、咖啡酸、綠原酸、白楊素、肉桂酸、香豆酸、矢車菊素、花青素-3-葡萄糖苷、兒茶素、飛燕草素、二氫山柰酚、二氫槲皮素、二氫槲皮素-3-O-鼠李糖苷、圣草酸、香豆酸乙酯、沒食子酸乙酯、阿魏酸、沒食子酸、龍膽酸、橙皮苷、鄰羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、金絲桃苷、異鼠李素、異槲皮素、異鼠李素-3-葡糖苷、山柰酚、山柰酚-3-葡糖苷、山柰酚-3-蕓香糖苷、錦葵素、錦葵花素-3-葡萄糖苷、二甲基花翠素葡萄糖苷、沒食子酸甲酯、沒食子酸甲酯-咖啡酸、楊梅素、楊梅酮-3-木糖苷、楊梅酮-3-鼠李糖苷、柚皮素、芍藥素、甲基花青素葡萄糖苷、矮牽牛素、對羥基苯甲酸、原花青素B1、柚皮苷、原矢車菊素B1、原矢車菊素B3、原兒茶酸、槲皮素、槲皮素-D-木糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-蕓香糖苷、反式-白藜蘆醇、鼠李黃素、蘆丁、水楊酸、介子酸、丁香亭-3-葡萄糖苷、丁香酸、反式-咖啡酸、香草酸。

1.3.6 酚類物質分離與標準曲線建立

利用UPLC-IM-QTOF-MS在無核白葡萄中鑒定到主要的14 種酚類物質，通過標準品確定線性回歸方程，如表1所示。該檢測體系分離度、線性關系良好，R2均達到0.99以上。鑒定出的酚類物質有槲皮素、鄰羥基苯甲酸、反式-咖啡酸、對羥基肉桂酸、原花青素B2、山柰酚、順式-白藜蘆醇、異鼠李素、蘆丁、兒茶素、阿魏酸、楊梅素、香草酸、山柰酚-3-葡萄糖苷。

表1 無核白葡萄中14 種酚類物質標準品的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations for 14 phenolics standards of Thompson seedless grapes

1.3.7 無核白葡萄酶促褐變底物的鑒定

多酚氧化酶提取：準確稱取10.0 g無核白葡萄，加入18 mL 0.2 mol/L pH 5.8預冷的磷酸鹽緩沖液，用均質機磨成勻漿，在4 ℃冰箱中浸提2.9 h，在4 ℃以9 000 r/min離心15 min，去除沉淀，取上清液，重復1 次，得到無核白葡萄多酚氧化酶提取液。

多酚氧化酶活力測定：在試管中加入3 mL 0.2 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液、1 mL 0.1 mol/L不同標準品（原花青素B2、山柰酚-3-葡糖苷、槲皮素、鄰羥基苯甲酸、山柰酚、對羥基肉桂酸、異鼠李素、蘆丁、兒茶素、順式-白藜蘆醇、阿魏酸、楊梅黃素、香草酸、反式-咖啡酸）溶液和1 mL多酚氧化酶提取液，混合均勻，在420 nm波長處測定其4 min內的吸光度變化，每隔30 s測一次吸光度[22]，按下式計算酶活力。通過酚類物質與多酚氧化酶是否發生反應確定無核白葡萄酶促褐變底物。

式中：Vr為磷酸鹽緩沖液體積/mL；Vs為標準品溶液體積/mL；m為樣品質量/g；t為測定時間/min；△A為4 min內吸光度變化量。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用Origin 8.5軟件作圖，并采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和相關性分析，采用鄧肯氏多重比較法進行差異分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 無核白葡萄干制過程中褐變度和總酚含量的變化

圖1 無核白葡萄在干制過程中褐變度（A）和總酚含量（B）的變化Fig. 1 Changes in browning degree (A) and total phenolic content (B)in Thompson seedless grapes during dehydration process

由圖1A可知，無核白葡萄在脫水過程中褐變度總體呈現上升的趨勢。褐變度在質量損失50%～70%這一階段顯著增加（P＜0.05），隨著質量損失率的增加，褐變程度越來越嚴重。在脫水結束時，無核白葡萄褐變度為0.297，為初始值的2.7 倍。由圖1B可知，無核白葡萄在脫水過程中總酚含量總體呈現下降的趨勢，無核白葡萄在質量損失率40%～50%階段總酚含量顯著增加（P＜0.05），這與葡萄開始出現明顯褐變現象的時間相符。前人研究發現30 ℃熱風干制第8天總酚含量突然增加，此時葡萄開始出現明顯褐變現象[23]，與本研究結果相同。

2.2 無核白葡萄干制過程中酚類物質組成、含量的變化

表2 無核白葡萄干制過程中單體酚類物質組成和含量Table 2 Loss of phenolic substances in Thompson seedless grapes during dehydration processμg/g

如表2所示，無核白葡萄脫水干制過程中原花青素B2、槲皮素、蘆丁含量整體呈現顯著下降趨勢，其中在鮮無核白葡萄中原花青素B2含量為37.57 μg/g，在脫水結束時只有10.24 μg/g，降低了72.74%，降低幅度最大。鄰羥基苯甲酸從最開始的0.37 μg/g降低至0.27 μg/g，降低速率最慢。山柰酚、對羥基肉桂酸、異鼠李素、阿魏酸、楊梅黃素、香草酸含量整體呈現上升趨勢，其中山柰酚在鮮樣中的含量是1.09 μg/g，質量損失率80%時增加了4.90 μg/g；阿魏酸含量上升最慢，從質量損失率30%時的0.94 μg/g上升至1.36 μg/g，僅上升了0.42 μg/g。在質量損失率50%時，原花青素B2、對羥基肉桂酸、兒茶素、順式-白藜蘆醇、阿魏酸、反式-咖啡酸含量突然升高后再下降，與無核白葡萄在質量損失率50%時褐變度、總酚含量明顯上升的結果相符。楊梅黃素、香草酸分別在質量損失率20%和40%時才開始出現，且其含量隨著質量損失率的增加而增加，這是因為楊梅黃素和香草酸自身為淡黃色，隨著質量不斷地損失，無核白葡萄褐變程度也在不斷加深，而楊梅黃素、香草酸含量不斷增加，加速了無核白葡萄表皮顏色的變化。

2.3 無核白葡萄多酚氧化酶底物鑒定

表3 無核白葡萄多酚氧化酶對不同底物催化褐變活性Table 3 Browning activity of polyphenol oxidase in Thompson seedless grapes to different substrates

不同植物所含的酚類物質含量和種類各不同，參與褐變過程的主要酚類物質也不同[21]。由表3可知，多酚氧化酶催化兒茶素褐變的酶活力是35.86 U/mL，是催化阿魏酸褐變的酶活力（1.24 U/mL）的28.92 倍（P＜0.05）。無核白葡萄多酚氧化酶對主要酚類物質催化褐變的酶活力大小依次為：兒茶素＞反式-咖啡酸＞順式-白藜蘆醇＞對羥基肉桂酸＞原花青素B2＞阿魏酸，而無核白葡萄多酚氧化酶對山柰酚、山柰酚-3-葡糖苷、槲皮素、異鼠李素、蘆丁、鄰羥基苯甲酸、楊梅黃素和香草酸無反應活性。說明無核白葡萄酶促褐變的底物主要是兒茶素，其次是反式-咖啡酸和順式-白藜蘆醇。

2.4 總酚及部分酚類物質含量與褐變度間的相關性分析

表4 總酚及部分酚類物質含量與褐變度之間的相關性Table 4 Correlation between total and individual phenolics contents and browning degree

由表4可知，無核白葡萄褐變度與總酚含量相關性最高，為-0.920；與阿魏酸含量相關性最小，為0.452。相關性由高到低為：總酚含量＞兒茶素含量＞反式-咖啡酸含量＞順式-白藜蘆醇含量＞對羥極肉桂酸含量＞原花青素B2含量＞阿魏酸含量。脫水干制過程中無核白葡萄褐變度與總酚含量呈極顯著負相關，與兒茶素含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；與反式-咖啡酸和順式-白藜蘆醇含量呈顯著正相關（P＜0.05）；與阿魏酸含量相關性不顯著。無核白葡萄脫水干制過程中，總酚、原花青素B2含量與褐變度呈顯著負相關（P＜0.05），說明隨著干制時間的延長和褐變度的提高，總酚和原花青素B2含量在逐漸減少，總酚和原花青素B2參與酶促褐變的發生。

3 討 論

3.1 無核白葡萄酚類物質組成特征

酚類物質是葡萄中重要的次生代謝產物，與葡萄的抗病性、采后運輸、貯存、保鮮及葡萄汁、葡萄酒的色澤、風味、褐變等密切相關[24]。前人測定了無核白營養系W1、W2、W3、W5、W6、W7、W8和長粒無核白、長穗無核白、大粒無核白10 種不同營養系的無核白葡萄的酚類物質組成，共檢測出19 種酚類物質[17]，本研究中檢測出主要的14 種酚類物質。同一品種葡萄不同種及處理方式不同會導致其酚類物質組成、含量的差異。無核白葡萄果實中主要存在酚酸類、黃酮醇類、黃酮類、花色苷類物質。本研究檢測到無核白葡萄中存在酚酸類5 種（反式-咖啡酸、阿魏酸、香草酸、鄰羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸）、黃酮類6 種（兒茶素、原花青素B2、槲皮素、楊梅黃素、蘆丁、山柰酚）、黃酮糖苷類1 種（山柰酚-3-葡萄糖苷）、黃酮醇類1 種（異鼠李素）、芪類1 種（順式-白藜蘆醇）。驗證了前人的結果，并進一步證明了原花青素B2、兒茶素、山柰酚在無核白葡萄中含量較多。

3.2 葡萄干制過程中酚類物質含量與褐變度的關系

褐變與酚類物質密切相關[25-27]。Singleton等的研究證明無核白葡萄在曬干過程中咖啡酸消失，但是如果葡萄在室溫、遮光的條件下干燥，咖啡酸含量在最初一段時間內基本保持不變，然后突然消失，同時葡萄開始褐變[28]。María等[29]在研究葡萄曬干過程中酚類物質與褐變的關系時，認為干燥過程中對羥基肉桂酸酯和黃烷-3-醇衍生物發生氧化降解是導致葡萄褐變的重要原因。Karadeniz等[30]也發現葡萄干多酚類成分中黃酮醇化合物對酶促褐變的反應不如羥基肉桂酸化合物（肉桂酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸等）敏感，但在干制過程中原花青素和黃烷-3-醇類基本降解完全。Hogan等[31]認為葡萄的褐變度與總酚、原花青素、兒茶素和根皮苷含量相關性較高。在本研究中，無核白葡萄主要酚類物質中有6 種與多酚氧化酶發生反應，即原花青素B2、對羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇、阿魏酸。在干制過程中的褐變度與總酚、原花青素B2、對羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇含量顯著相關，這與前人的研究結果有相同之處也有不同之處：相同之處為本研究中咖啡酸參與了酶促褐變，但是并未消失，只是含量呈現降低的趨勢，羥基肉桂酸化合物（咖啡酸、阿魏酸）對酶促褐變較為敏感，且總酚、原花青素B2、兒茶素含量與褐變度相關性高；不同之處為無核白葡萄在干制過程中原花青素B2和黃酮類（兒茶素）未降解完全，且含量很高，這可能是葡萄品種和處理方式不同所致。本研究中發現無核白葡萄干制過程中出現明顯褐變現象時，這6 種酚類物質含量都突然增加隨后減少，這與汪淼等[32]研究甘蔗莖尖在組織培養過程中褐變時酚類物質的變化情況相同。說明酚類物質在參與酶促褐變時會聚合產生較多的酚類單體，從而導致酶促褐變的發生。非酶促褐變是酚類物質等在非酶促條件下被氧化而發生的顏色加深的現象[33]。無核白葡萄在干制過程中只有原花青素B2、槲皮素、蘆丁含量呈現顯著下降趨勢，而總酚含量減少了80%左右，說明酚類物質可能部分參與了非酶促褐變，導致總酚含量急劇減少以及無核白葡萄干顏色的加深；也有可能是因為脫水過程本身就是一種脅迫，為緩解脫水脅迫引起的膜脂過氧化、保護細胞膜免受或減少損傷導致總酚含量減少以起到保護作用[34]，具體原因需進一步實驗驗證。

綜上，本研究檢測到無核白葡萄中主要的酚類物質有14 種，其中原花青素B2、對羥基肉桂酸、兒茶素、順式-白藜蘆醇、阿魏酸、反式-咖啡酸可作為酶促褐變的底物，除阿魏酸以外，其他5 種酚類物質含量在無核白葡萄干制過程中與褐變度呈現顯著相關性，說明這幾種酚類物質與無核白葡萄干制過程中的酶促褐變密切相關。另外，實驗中檢測到的楊梅黃素、香草酸因其本身顏色淡黃，且隨著干制的進行含量增加，推測這兩種酚類物質在無核白葡萄干制褐變中也起到了一定的作用。本研究結果可為闡釋無核白葡萄干制過程中褐變機理以及提高無核白葡萄干品質提供理論依據。