低溫超微粉碎對生物酶法制油豆渣蛋白結構影響的拉曼光譜分析

吳長玲，尋崇榮，劉寶華，王中江，滕 飛，江連洲，李 楊*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

生物酶法制油作為一種新興的“綠色、環保”提油技術，在提取油脂的同時能高效地回收油料中其他有價值組分，與傳統工藝相比，其在能耗、環境保護和安全衛生等方面具有顯著優勢，且操作條件溫和、工序簡單[1-4]。現階段國內外學者針對生物酶法制油技術的研究主要集中在預處理、酶解工藝條件、乳狀液破除、油脂釋放機制及油脂品質等方面，對于大豆加工過程副產物的研究主要集中在豆腐、豆漿殘渣，而針對生物酶法制油豆渣的相關研究不多，對豆渣組分中蛋白結構、作用機理及潛在生物活性更是鮮有研究[5-8]。

針對目前豆渣利用率低且浪費嚴重的現狀，許多學者對大豆加工副產物的深加工技術進行了研究，主要運用超微粉碎及螺桿擠壓改性處理技術研究大豆豆渣粒度和加工性質，發現超微粉碎處理使豆渣具有一般顆粒所沒有的特殊理化性質，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化學反應活性等[9-11]。另外，有研究證實超微粉碎程度會促進大豆和原料中蛋白質的堿提取[12]。同時，Le Gall等[13]研究了粒度對豌豆粉蛋白質提取率的影響，發現隨著粉碎程度的降低，面粉的平均粒度增加，而豌豆粉提取的蛋白質量分數從73.6%下降到37.4%。Russin等[14]研究發現分別經3 種不同研磨篩處理的脫脂豆粉，其蛋白提取率不同，說明粒度對蛋白回收有明顯影響，這與Le Gall等[13]的研究結果相似。綜上所述，超微粉碎對植物蛋白分離、回收及理化性質影響顯著，與其他方法相比超微粉碎具有技術簡單、成本低和可持續的優勢，但超微粉碎的高速剪切作用使得體系溫度升高，為避免高溫對蛋白構象的影響，本研究采用低溫超微粉碎處理生物酶法制油的豆渣。

拉曼光譜是一種基于拉曼散射和瑞利散射效應的光譜學分析技術，廣泛應用于蛋白質空間結構的研究中，它可以通過鑒別蛋白質結構特征峰的變化，得到蛋白質分子多肽鏈骨架構型改變的信息和分子側鏈微環境變化的信息[15]。拉曼光譜在不破壞樣品的情況下可提供豐富的蛋白質結構信息，故本研究主要采用拉曼光譜深入解析豆渣蛋白結構。

本研究利用低溫超微粉碎處理生物酶法制油豆渣，采用拉曼光譜分析豆渣蛋白經不同粉碎程度處理后豆渣蛋白的結構變化，并對其主要的碳鏈與側鏈構象進行研究。旨在通過低溫超微粉碎的處理方式高效回收豆渣蛋白，為生物酶法豆渣中蛋白的分離、純化及回收提供理論指導和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆生物酶法制油豆渣由實驗室自制；α-淀粉酶（DA4251，酶活力≥10 000 U/g） 合肥泊美生物科技有限責任公司；纖維素酶（酶活力≥10 000 U/g） 上海國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

S22-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C雷磁pH計 上海精科儀器有限公司；SWFJ超微粉碎機 廣州市旭朗機械設備有限公司；TDL-408臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-4數顯攪拌水浴鍋 常州賽普實驗儀器廠；鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制油豆渣的制備

對Li Yang等[16]的方法進行適當修改，將市售大豆粉碎過60 目篩，取200 g過篩后的粉體，按料液比1∶6加入蒸餾水，待攪拌均勻后放入55 ℃水浴鍋內進行酶解，酶解條件為：酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、pH 9.0、堿性蛋白酶Protex6L（8 900 U/mL）添加量0.5%（體積分數），邊攪拌邊酶解，酶解結束后取出并用1 mol/L HCl溶液調節水溶液pH值至7，之后在100 ℃沸水中滅酶5 min，將滅酶后的溶液于4 500 r/min離心20 min，豆渣在平板鋪平后置于55 ℃鼓風烘箱，待恒質量后取出研磨即得生物酶法制油豆渣。

1.3.2 低溫超微粉碎處理豆渣的制備

由于豆渣中的脂肪氧化后會產生異味并影響提取率[17]，因此在低溫超微粉碎前按照楊夢曦等[18]的處理方法除去脂肪。然后，采用超微粉碎機在-4 ℃下超微粉碎酶法制油豆渣（水分質量分數≤4%），粉碎時間30 s，出料粒度分別為100、200、300 目，然后烘干至質量恒定，即得所需豆渣樣品。

1.3.3 未處理及常溫超微粉碎處理豆渣的制備

未處理組即不經超微粉碎處理，其他步驟與1.3.2節一致。常溫超微粉碎處理組于常溫（25 ℃）下操作，出料粒度為200 目，其他步驟同1.3.2節。

1.3.4 豆渣蛋白的提取

根據Petruccelli等[19]的方法提取渣蛋白。取150 g豆粉，用正己烷以料液比1∶6混合脫脂3 次，得到脫脂豆粕，將脫脂豆粕按1∶10的質量比與水混合，用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.5，45 ℃攪拌2 h后，將其懸浮液在4 ℃條件下10 000×g離心20 min，取上清液再用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.5。靜置后在4 ℃條件下6 000×g離心20 min，得蛋白沉淀后水洗2 次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0。再在4 ℃條件下10 000×g離心30 min，除去少量的不溶物，將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀大豆分離蛋白。

1.3.5 超微粉碎處理前后豆渣蛋白的拉曼光譜分析

采用Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀。激發光波長為785 nm，激光功率為80 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，每次掃描時間60 s，積分10 次，4 次掃描進行累加。以苯丙氨酸（（1 003±1）cm-1）作為歸一化因子，采用ACD Labs V12軟件進行譜圖基線校正、譜峰歸屬查找，最終進行豆渣蛋白的拉曼光譜分析。

1.4 數據統計及分析

所有的實驗至少進行3 次，利用SPSS Statistics 22軟件對數據進行差異顯著性分析（方差分析），P＜0.05為差異顯著。分別采用Origin 8.5、PeakFit 4.12軟件進行數據分析、圖表處理及圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 豆渣蛋白主鏈結構特征拉曼光譜分析

為了有效分析經低溫超微粉碎處理生物酶法制油豆渣中蛋白組分結構特征，本研究采用拉曼光譜進行分析研究，結果如圖1所示。

圖1 不同粉碎條件下豆渣蛋白拉曼光譜Fig. 1 Raman spectra of soybean meal protein ground to different particle sizes

表1 拉曼光譜峰位歸屬Table 1 Attribution of Raman spectral peaks

參考拉曼光譜峰位歸屬（表1），豆渣蛋白酰胺I帶拉曼特征峰位置為：α-螺旋結構歸屬峰位（1 645～1 660 cm-1）；β-折疊結構（1 670～1 680 cm-1）；β-轉角結構（1 680～1 690 cm-1）；無規卷曲結構（1 660～1 670 cm-1）。本研究中拉曼圖譜二級結構含量的定量計算由PeakFit 4.12軟件分析完成，圖2所示為豆渣蛋白拉曼譜帶在1 600～1 700 cm-1區域內的擬合圖譜。

圖2 豆渣蛋白拉曼譜帶在1 600～1 700 cm-1區域內的擬合圖譜Fig. 2 Raman fitting curves of soybean meal protein in the range of 1 600-1 700 cm-1

表2 超微粉碎改性處理豆渣蛋白二級結構組分含量Table 2 Percentages of protein secondary structures in soybean meal subjected to different treatments

將豆渣蛋白的酰胺I帶用于研究豆渣蛋白二級結構分析，結果如表2所示。經低溫超微粉碎后豆渣蛋白中β-轉角及無規卷曲結構含量顯著下降（P＜0.05），常溫超微粉碎后豆渣蛋白無規卷曲結構含量降至12.54%，β-轉角結構含量顯著增加（P＜0.05）。隨著低溫超微粉碎程度的不斷加劇，豆渣蛋白α-螺旋及β-折疊含量分別呈現先增加后下降、先下降后上升的變化趨勢。經低溫超微粉碎處理與常溫處理豆渣蛋白二級結構組分均以α-螺旋、β-折疊為主。另外發現與未處理豆渣蛋白相比，常溫超微粉碎處理后豆渣蛋白無規卷曲結構含量較低溫超微粉碎下降趨勢更為明顯。

與未處理條件對比，超微粉碎的高剪切作用使蛋白分子間的相互作用逐漸減弱，其疏水結合及離子結合可能因體積的縮小被切斷，蛋白質分子伸展，非極性基團暴露，分子間疏水作用增強，氫鍵作用逐漸減弱，導致豆渣蛋白α-螺旋與β-折疊結構的加和增加，β-轉角及無規卷曲結構含量下降，這與Rahmeh等[20]通過熒光光譜分析分子間偶聯程度對G蛋白表面疏水作用影響的研究結果一致。另外，蛋白質二級結構隨蛋白質聚合程度而變化，較高程度的蛋白質聚合與穩定的二級結構的積聚高度相關，α-螺旋和β-折疊構象比例高，表明超微粉碎處理后，豆渣蛋白分子間有序結構增加，蛋白質聚合增強。由于粉碎過程中蛋白粒徑減小，比表面積大幅增加，豆渣蛋白聚合程度增強，從而導致豆渣蛋白這種結構單元變化的發生，這與Xiong Licheng[21]、Hou[22]和Belton[23]等的研究結果一致。同時，Xiong Licheng[21]和Lee[24]等的研究表明，精磨粉碎處理后蛋白質二級結構β-折疊結構含量的增加和β-轉角結構含量的減少，表明形成了更多的聚合和穩定的谷蛋白網絡，豆渣蛋白二級結構更趨有序化，印證了本研究中α-螺旋結構含量增加、β-轉角及無規卷曲結構含量下降的趨勢。

與低溫超微粉碎條件相比，常溫粉碎在高速剪切作用過程中對豆渣蛋白存在溫度效應，處理過程中使部分豆渣蛋白變性，蛋白結構發生解折疊，蛋白分子內疏水性氨基酸暴露，導致分子間作用力下降，故豆渣蛋白β-折疊含量總體增加不明顯，β-轉角結構增加明顯，說明常溫粉碎處理下，部分無規卷曲結構轉變成β-轉角結構。這可能是由于超微粉碎處理溫度能先讓蛋白解聚，使蛋白分子充分展開，分子內埋游離巰基暴露，而暴露的游離巰基在常溫粉碎溫度下被氧化形成分子間或分子內二硫鍵，蛋白分子重新聚合形成新的聚集體造成蛋白三級結構的改變，進而引起二級結構單元含量發生相應變化[25]。

隨著低溫超微粉碎目數的增加（100～200 目），超微粉碎的這種高剪切作用不斷加強，導致豆渣蛋白分子間碰撞作用增強，分子間的相互作用逐漸減弱，氫鍵作用逐漸減弱，故豆渣蛋白α-螺旋含量與β-折疊含量比值增加，無規卷曲含量呈上升趨勢；當粉碎程度達到200 目時，豆渣蛋白分子間碰撞作用停止，粉碎程度繼續增加，氫鍵作用反而增大，分子間作用增強，故出現豆渣蛋白α-螺旋含量與β-折疊含量比值下降現象。

2.2 豆渣蛋白側鏈結構特征拉曼光譜分析

已有研究表明蛋白質結構改變能夠引起色氨酸殘基的暴露，760 cm-1附近區域的拉曼峰強度降低與色氨酸殘基由原本“包埋態”轉變為“暴露態”有關，在拉曼譜圖中表現為色氨酸譜帶強度的降低[26-29]。由表3可以看出，與未經超微粉碎處理的豆渣蛋白相比，低溫超微粉碎處理引起760 cm-1附近區域的拉曼光譜峰強度降低，表明色氨酸殘基趨向于“暴露態”。而較未處理豆渣蛋白，常溫超微粉碎處理引起760 cm-1附近區域的拉曼光譜峰強度升高，表明色氨酸殘基趨向于“包埋態”。色氨酸殘基的暴露是由于超微粉碎處理使蛋白質結構改變，分子結構展開導致的；而常溫超微粉碎處理下色氨酸殘基的包埋可能與超微粉碎溫度導致豆渣蛋白部分變性有關[30]。在本研究中，經低溫超微粉碎（200 目）處理的豆渣蛋白在760 cm-1附近區域的色氨酸拉曼光譜峰強度較低，該區域歸屬于色氨酸殘基的伸縮振動，表明此條件下色氨酸殘基更趨于“暴露態”，這與上述不同粉碎程度下分子碰撞作用影響有關。

Herrero等[29]研究指出850 cm-1和830 cm-1是酪氨酸殘基苯環的呼吸振動和面外彎曲倍頻之間的費米共振。如表3所示，I850/I830比值分布于0.99～1.09之間，表明所測豆渣蛋白的酪氨酸殘基暴露于溶液的極性微環境下作為中性強度氫鍵的供體或受體。與未經超微粉碎處理的豆渣蛋白相比，低溫超微粉碎處理時酪氨酸費米共振線（I850/I830）比值較小，表明酪氨酸殘基微環境在低溫超微粉碎過程中得以保持。然而，在常溫超微粉碎處理條件下，I850/I830比值降低到0.99，較低溫超微粉碎下降更為明顯，這表明超微粉碎處理溫度會導致酪氨酸殘基暴露程度加劇。由此可以推測經超微粉碎處理后豆渣蛋白的酪氨酸應更趨于“暴露態”，且粉碎程度過大會導致酪氨酸“暴露”程度降低。這表明超微粉碎破壞了維持蛋白質三級結構的主要作用力，使包埋于豆渣蛋白分子內部的酪氨酸殘基暴露于分子表面，并作為氫鍵的供體或受體與水相互作用[31]。但隨著粉碎程度加大，分子間碰撞作用停止，分子間氫鍵作用增強，導致疏水性氨基酸酪氨酸殘基暴露程度降低。

另外，Ngarize[32]和Ferrer[33]等的研究表明1 450 cm-1是脂肪族氨基酸的拉曼歸屬譜線，脂肪族氨基酸的拉曼歸屬峰強度降低與脂肪族氨基酸暴露有關。在本研究中，經超微粉碎作用下的豆渣蛋白在1 450 cm-1處的拉曼歸屬峰強度總體低于未處理方式，這與豆渣蛋白在超微粉碎過程中的結構重排有關。另發現常溫超微粉碎較低溫超微粉碎I1450/I1003比值下降更明顯，表明常溫超微粉碎的高剪切作用會導致部分豆渣蛋白變性，從而影響蛋白質三級結構，與上述2.1節分析結果一致。

表3 不同處理條件下豆渣蛋白側鏈基團譜帶強度Table 3 Band intensities of side chain groups in soybean meal protein subjected to different treatments

2.3 豆渣蛋白二硫鍵拉曼光譜分析

de Vuyst[34]和王中江[35]等的研究表明在拉曼譜圖中500～550 cm-1范圍內是二硫鍵的特征譜帶，二硫鍵在不同振動模式下所反映出的拉曼光譜位移有所不同，其中，500～515 cm-1處為gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm-1處為gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，525～545 cm-1處為trans-gauche-trans（t-g-t）模式。為了探究超溫粉碎改性對豆渣中豆渣蛋白二硫鍵的影響，本研究運用Peak Analyzer軟件進行多峰值Guassina擬合處理。

圖3 豆渣蛋白拉曼譜帶在500～550 cm-1區域內的高斯擬合圖Fig. 3 Raman Gaussianves fitting curves of soybean meal protein in the region of 500-550 cm-1

從圖3可以看出，擬合譜線重新合成的譜線與實驗數據貼近，證明擬合結果是準確的。對擬合的各個高斯峰值進行歸屬，各處理方式豆渣蛋白的二硫鍵的振動模式歸屬情況如表4所示。本研究運用各個峰的高度計算各振動模式的百分比，以及二硫鍵的數量。結合表4及圖3的分析，經超微粉碎處理后g-g-g與g-g-t模式百分比下降顯著，t-g-t模式百分比顯著增加，且隨著物料粉碎程度的加劇，二硫鍵數量變化較為明顯，這可能是由于超微粉碎處理破壞大的蛋白顆粒的同時，使得埋藏在內部的游離巰基暴露，從而被氧化形成二硫鍵，這與Chan等[36]的研究結果一致。另外，常溫超微粉碎過程中剪切力產生的溫度效應會引起豆渣蛋白結構解折疊現象，分子間作用力下降，導致分子內二硫鍵數量下降，故常溫超微粉碎處理下二硫鍵中g-g-g模式含量顯著下降。隨著粉碎目數的增加，豆渣蛋白t-g-t模式含量分別呈現先下降后增加的變化趨勢，說明超微粉碎高速剪切處理將大顆粒蛋白聚集體破壞，形成新的小顆粒的過程中也有部分游離巰基暴露氧化成二硫鍵，造成蛋白三級結構的改變；同時，t-g-t模式含量的增加表明超微粉碎程度的加深使豆渣蛋白分子間作用力增強。可以得到結論：超微粉碎作用能夠顯著改變豆渣中豆渣蛋白的二硫鍵構型，由g-g-g構型向t-g-t構型轉變，這種變化表現出一種非線性變化趨勢，經超微粉碎處理后t-g-t構型成為豆渣蛋白二硫鍵的主要構型。共價二硫鍵和非共價相互作用（如氫鍵、離子鍵和疏水鍵）有助于形成穩定豆渣蛋白結構，這與Domenek等[37]的研究結果相似。

表4 豆渣蛋白在500～550 cm-1區域擬合結果Table 4 Fitting results of soybean meal protein in the region of 500-550 cm-1

3 結 論

生物酶法制油豆渣經低溫超微粉碎處理后，豆渣蛋白改性前后二級結構發生顯著變化，處理后豆渣蛋白中無序二級結構單元含量明顯降低，其中α-螺旋結構含量增加，改性后β-轉角結構含量降低至幾近為零；通過I760/I1003、I850/I830及I1450/I1003拉曼強度比值發現經超微粉碎改性處理的豆渣中，豆渣蛋白的疏水性基團暴露程度高于未超微粉碎處理方式；超微粉碎處理改變了豆渣中蛋白的二硫鍵構型，經超微粉碎處理后t-g-t模式含量顯著增加，呈現出了一種非線性變化趨勢；對比低溫、常溫超微粉碎發現，在-4 ℃超微粉碎條件下豆渣蛋白二級結構變化更趨明顯。