LP-8大孔樹脂制備高含量酯型兒茶素茶多酚

陳 琳，呂楊俊，張海華，朱躍進，王岳飛，張士康,*

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江省茶資源跨界應用技術重點實驗室，浙江 杭州 310016；2.浙江大學農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058）

茶多酚占茶葉干物質質量的18%～36%[1]，是茶葉中重要的組成成分。目前茶多酚已實現了工業化生產，所用原料一般為低檔綠茶，且茶多酚產品已有相應的國家標準GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》。據不完全統計，全國每年生產茶多酚的總量為3 000 t左右[2]。目前從茶葉中生產制備茶多酚仍主要依賴于溶劑萃取法，即利用水或乙醇浸提，經氯仿或二氯甲烷萃取以脫除咖啡堿，再經乙酸乙酯萃取得到茶多酚。現有方法存在不同程度的食品安全隱患和環保壓力，隨著消費者對茶多酚產品安全性要求越來越高，新的生產工藝也在涌現，例如以不同類型吸附材料為基礎的吸附分離法[3-12]、超臨界萃取法[13-16]等。但超臨界萃取等新技術要求高、設備昂貴，距離工廠化生產應用尚待時日。另外，目前茶多酚的制備研究主要集中在提高多酚純度，較少關注其中酯型或非酯型兒茶素的比例。大孔樹脂作為一種吸附材料，具有價格適宜、可再生、熱及化學穩定性較優、選擇性較好等優點，研究表明適宜的大孔樹脂可以實現分離制備茶多酚[3-4,17-20]，且使用的溶劑以水和/或乙醇為主；因此大孔樹脂具備工廠化、綠色化生產茶多酚的可行性。本實驗所用的LP-8大孔樹脂為自制材料，基于對茶多酚有特異吸附性的大孔樹脂，通過優化樹脂成粒工藝，引入對酚羥基具有較強吸附作用的聚酰胺基吸附基團，制得優選粒徑樹脂，既提高大孔樹脂對茶多酚的負載量（提高46.2%），亦不影響常壓下上樣、洗脫流速，實現酯型兒茶素（表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG））與簡單兒茶素的較好分離[1]。綜上所述，本實驗采用LP-8大孔樹脂制備高含量酯型兒茶素茶多酚，探討大孔樹脂制備茶多酚的技術可行性，以期獲得有別于現市場流通的差異化茶多酚樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LP-8大孔樹脂，自制；兒茶素、咖啡堿標準品（純度≥98%） 中國藥品生物制品檢定所；湖北恩施大宗綠茶 杭州遠圣茶能科技有限公司；無水乙醇、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 天津四友精細化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

YF-20型提取罐 北京東華原醫療設備有限公司；YC-015型噴霧干燥機 上海雅程儀器設備有限公司；TU1901型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司；φ 4 cm×50 cm玻璃層析柱 華東醫藥股份有限公司；RE-52A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 綠茶水提取物的制備

準確稱取0.5 kg碾碎的綠茶，按固液比1∶15（m/V）加去離子水，置于提取罐中混勻。設定浸提溫度85 ℃，浸提時間30 min，收集濾液。保留濾渣，同一條件進行二次浸提，收集濾液。合并濾液，濃縮、干燥，得綠茶水提取物固體粉末。

1.3.2 茶多酚、兒茶素、咖啡堿質量分數的測定

參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類質量分數的檢測方法》對茶多酚、兒茶素、咖啡堿質量分數進行測定，該方法中兒茶素類質量分數＝表兒茶素質量分數+表沒食子兒茶素質量分數+沒食子兒茶素質量分數+EGCG質量分數+ECG質量分數，因此本實驗所述酯型兒茶素質量分數是指：EGCG質量分數+ECG質量分數。

1.3.3 LP-8大孔樹脂對茶多酚的吸附及洗脫能力測定

準確稱取濕質量2.0 g的LP-8大孔樹脂，裝入100 mL錐形瓶中，加入6 mg/mL綠茶水提取物溶液200 mL，室溫下振蕩12 h進行充分吸附后測定溶液中茶多酚、酯型兒茶素（EGCG、ECG）及咖啡堿含量，并計算LP-8大孔樹脂對茶多酚的吸附量（式（1））。同時，在吸附結束時，取出大孔樹脂，用濾紙吸干表面水后置于錐形瓶中，加入100 mL的體積分數70%乙醇溶液，室溫下恒溫振蕩12 h進行洗脫，洗脫結束后測定溶液中的茶多酚、酯型兒茶素（EGCG、ECG）及咖啡堿含量，并計算LP-8大孔樹脂的洗脫率（式（2））。

1.3.4 LP-8大孔樹脂靜態吸附實驗

1.3.4.1 靜態吸附動力學實驗

準確稱取濕質量2 g的LP-8大孔樹脂，裝入500 mL錐形瓶中，加入240 mL的10 mg/mL綠茶水提取物溶液，室溫下恒溫振蕩。在吸附2、6、10、20、30、40、50、60、90、120 min時測定大孔樹脂對茶多酚的吸附量，并繪制靜態吸附動力學曲線。

1.3.4.2 LP-8大孔樹脂靜態吸附等溫線

準確稱取濕質量2 g的LP-8大孔樹脂6 份，裝入錐形瓶中。分別添加質量濃度為4、5、6、7、8、9 mg/mL的綠茶水提取物溶液各100 mL。25 ℃下恒溫振蕩。待平衡后，測定溶液中茶多酚含量，并計算吸附量，繪制25 ℃吸附等溫線，并進行Langmuir方程擬合。

1.3.5 LP-8大孔樹脂動態吸附實驗

當吸附過程中層析柱流出液內的茶多酚質量濃度達到上樣樣品中茶多酚質量濃度的10%時視為泄漏點[21-22]，判定為吸附飽和。

1.3.5.1 吸附流速對吸附泄漏點的影響

準確量取50 mL濕樹脂，進行濕法裝柱。綠茶水提取物上樣質量濃度為10 mg/mL，控制吸附流速分別為1、2 BV/h以及3 BV/h。收集每一床層體積流出液，并對流出液中的茶多酚含量進行測定。以流出液體積為橫坐標，流出液中茶多酚質量濃度占上樣樣品中茶多酚質量濃度的比例為縱坐標，作動態吸附曲線。

1.3.5.2 上樣質量濃度對吸附泄漏點對應的吸附量的影響

準確量取50 mL濕樹脂，進行濕法裝柱。配制上樣質量濃度分別為10、20、30 mg/mL以及40 mg/mL的溶液，控制吸附流速為1 BV/h。收集每一床層體積流出液，并對流出液中的茶多酚含量進行測定。計算達到泄漏點時，不同上樣質量濃度下的吸附量。

1.3.6 LP-8大孔樹脂動態洗脫實驗

采用濕法裝柱。配制0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%系列體積分數的乙醇溶液，各2 BV。以1 BV/h的流速進行梯度洗脫。每0.5 BV收集洗脫液，并測定茶多酚、酯型兒茶素、EGCG及咖啡堿的含量，繪制動態洗脫曲線。以酯型兒茶素含量為指標，確定適宜的乙醇洗脫體積分數梯度，以制得高含量酯型兒茶素茶多酚。

1.4 數據處理與分析

所有實驗重復3 次，數據處理采用SAS 9.1軟件，進行單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）和Tukey多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 原料茶中茶多酚、咖啡堿、兒茶素類物質的質量分數

經測定，本實驗中的原料茶——湖北恩施大宗綠茶中茶多酚質量分數為14.7%，咖啡堿質量分數為3.1%，兒茶素質量分數為10.6%，EGCG質量分數為6.3%，ECG質量分數為1.6%。

2.2 LP-8大孔樹脂對茶多酚的吸附及洗脫能力

從圖1可以看出，LP-8大孔樹脂對茶多酚具有極好的吸附效果，吸附量為64.6 mg/g，且對咖啡堿的吸附作用較弱，吸附量為2.3 mg/g。此外，吸附的茶多酚中，酯型兒茶素占了較大的比例，為69%。

圖1 LP-8大孔樹脂對茶多酚、酯型兒茶素、EGCG、ECG及咖啡堿的吸附能力Fig. 1 Adsorption capacity of resin LP-8 for tea polyphenols, esterified catechins, EGCG, ECG and caffeine

圖2 茶多酚、酯型兒茶素、EGCG、ECG及咖啡堿在LP-8大孔樹脂中的洗脫率Fig. 2 Desorption rates of tea polyphenols, esteri fied catechins, EGCG,ECG and caffeine on resin LP-8

從圖2中可以看出，體積分數70%乙醇溶液對LP-8大孔樹脂所吸附的茶多酚及酯型兒茶素具有較好的洗脫效果（洗脫率分別為93%、85%）；而對咖啡堿的洗脫效果則較弱，洗脫率約42%。

以上結果與已有的選擇性吸附洗脫茶多酚的大孔樹脂研究結果[17-20]類似。因此LP-8大孔樹脂具有用于分離制備綠茶高酯型兒茶素茶多酚的可行性。

2.3 LP-8大孔樹脂對茶多酚的靜態吸附動力學

圖3 茶多酚在LP-8大孔樹脂中靜態吸附量隨時間變化曲線Fig. 3 Static absorption curve for tea polyphenols on resin LP-8

從圖3可以看到，在0～120 min內茶多酚在LP-8大孔樹脂中的靜態吸附量隨著時間的延長而提高，但在60 min后變緩，且60 min與90、120 min時的吸附量無顯著差異。因此判斷60 min時，LP-8大孔樹脂對茶多酚吸附接近飽和，近似平衡。

2.4 LP-8大孔樹脂的靜態等溫吸附

LP-8大孔樹脂對茶多酚的靜態等溫吸附曲線（圖4）描述的是茶多酚在LP-8大孔樹脂中的平衡質量濃度與平衡吸附量的關系，可以看出平衡吸附量隨著平衡質量濃度的增加而提升，隨后在近50 mg/g時逐漸趨緩。

圖4 LP-8大孔樹對茶多酚的脂靜態吸附等溫線（25 ℃）Fig. 4 Adsorption isotherm of resin LP-8 at 25 ℃ for tea polyphenols

Langmuir方程模型是一種平衡模型，可用以擬合被吸附物在吸附劑上的等溫平衡吸附情況[23]。該模型有一個假設，即吸附劑表面均一，為單分子層對被吸附物的等溫吸附，各處的吸附能相等。該方程模型表達式如式（3）所示。

式中：ρe為被吸附物的平衡質量濃度/（mg/mL）；qe為吸附劑的平衡吸附量/（mg/g）；qm為吸附劑的飽和吸附量（假定為單分子層）/（mg/g）；K為能量常數。

用該模型對實驗得到的吸附等溫線進行擬合，得到相應的回歸方程，如圖5所示。

圖5 LP-8大孔樹脂吸附茶多酚的Langmuir方程模型（25 ℃）Fig. 5 Linear correlation for adsorption of tea polyphenols on LP-8 resin at 25 ℃ based on the Langmuir model

從擬合方程的R2＝0.991 6可以看出，該模型與LP-8大孔樹脂等溫吸附情況能較好擬合。根據擬合方程推算出LP-8大孔樹脂在25 ℃下的單分子層飽和吸附量qm為70.9 mg/g，該吸附量進一步驗證了LP-8大孔樹脂對茶多酚具有較好的吸附效果。

2.5 動態吸附下不同吸附流速的吸附效果

如圖6所示，在不同流速下，流出液中茶多酚質量濃度所占比例隨著流出液體積的增加而升高，且不同流速間有所差異。流速越大，相同流出體積下流出液中茶多酚質量濃度所占比例越高，即說明有更多的茶多酚未被LP-8大孔樹脂吸附。以出現所占比例超過10%的體積為泄漏點，由圖6可知，綠茶水提取物在LP-8大孔樹脂中以1 BV/h吸附流速在8 BV時出現泄漏點，以2 BV/h吸附流速在6 BV時出現泄漏點，以3 BV/h吸附流速在5 BV時出現泄漏點，即吸附流速越大，泄漏點越提前出現。在動態吸附中，以不同吸附流速過柱，茶多酚與大孔樹脂的接觸時間存在差異。流速越小，茶多酚與大孔樹脂的接觸時間越長，大孔樹脂對茶多酚的吸附越充分，即吸附量更高，吸附效果更佳[24]。因此，此后將1 BV/h設定為上樣流速。

2.6 動態吸附下不同上樣質量濃度的吸附效果

圖7 不同上樣質量濃度下LP-8大孔樹脂對茶多酚的飽和吸附質量Fig. 7 Saturated adsorption capacity of tea polyphenols onto LP-8 resin at different loading concentrations

如圖7所示，不同上樣質量濃度下，LP-8大孔樹脂對茶多酚的飽和吸附質量存在差異，且30 mg/mL具有更高的吸附量，為5.25 g。所以后續實驗以30 mg/mL的綠茶水提取物水溶液作為最佳上樣質量濃度。

2.7 制備高含量酯型兒茶素茶多酚

在上述吸附實驗結果基礎上，選擇環境友好且易獲得的乙醇作為洗脫劑，以實現高含量酯型兒茶素茶多酚的環境友好型制備。

圖8 不同乙醇體積分數下茶多酚的梯度洗脫曲線Fig. 8 Dynamic desorption curves of tea polyphenols with different ethanol concentrations

從圖8中可以看出，咖啡堿在乙醇體積分數大于20%的梯度洗脫液中均未檢出，表明其在0～20%體積分數乙醇梯度洗脫時已基本被洗脫完全；酯型兒茶素（EGCG+ECG）在0～30%體積分數乙醇溶液中幾乎未被洗脫，在乙醇體積分數不小于40%時逐漸被洗脫下來，且洗脫體積分數集中在40%～60%。合并40%～60%的洗脫液，測得其中酯型兒茶素在茶多酚中的比例為78.0%、EGCG為61.0%、ECG為17.0%，與原料相比，酯型兒茶素、EGCG、ECG在茶多酚中的比例分別提高了45.1%、42.2%和56.0%，無咖啡堿檢出。將洗脫液進行旋轉蒸發脫乙醇后干燥，得到高含量酯型兒茶素茶多酚樣品。

3 討 論

茶多酚作為茶葉中最主要的功能活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種功能活性[25-29]。其中EGCG、ECG等酯型兒茶素具有比其他茶多酚組分更強的活性[1]，其含量常作為茶多酚品質的評判指標。鑒于傳統的制備技術（金屬離子沉淀法、溶劑萃取法等）無法實現酯型兒茶素等特異成分的定向富集[2]，有研究者通過吸附分離法等技術對酯型兒茶素進行分離制備[30-31]，但規模化制備技術尚未普遍，填料篩選、工藝優化等相關研究仍是當前熱點。溫堯林等[32]采用ADS-F8大孔樹脂對茶多酚進行富集，制得低咖啡堿、高茶多酚的茶粉，其中茶多酚質量分數不小于85%，兒茶素質量分數不小于60%，EGCG質量分數不小于35%，咖啡堿質量分數不大于1%；李翠芹等[33]公開了一種無咖啡堿茶多酚分離純化的方法，利用LX-8大孔樹脂制備茶多酚質量分數大于96%、EGCG質量分數大于60%的茶多酚產品；綜上，有關大孔樹脂分離茶多酚乃至EGCG的研究相對已成熟，尚缺少針對酯型兒茶素特異吸附相關的研究，尤其是特異性吸附材料的篩選應用研究。

本實驗以便于工業化生產為目標，應用LP-8大孔樹脂對綠茶提取物進行分離，經靜態、動態吸附實驗，系統研究LP-8樹脂對茶多酚、咖啡堿、EGCG、ECG、酯型兒茶素的吸附、洗脫特性，結果表明：LP-8樹脂對茶多酚、咖啡堿、酯型兒茶素有選擇性吸附、洗脫特性，通過工藝優化可實現酯型兒茶素含量高、脫咖啡堿茶多酚的制備。在吸附流速1 BV/h、上樣質量濃度30 mg/mL的動態吸附和40%～60%乙醇梯度動態洗脫條件下，獲得了酯型兒茶素比例為78.0%的茶多酚，實現了高含量酯型兒茶素茶多酚的制備，該含量優于現有一些相關研究結果[23-34]，本方法可獲得有別于目前市場流通的差異化茶多酚樣品，為工業化推廣提供參考。后續大量工作仍需繼續開展，如進一步優化吸附洗脫條件、干燥方式等。