紫薯花色苷在貯藏過程中的降解特性

江 甜，李 佳，楊 寧，何 毅，祝振洲，李書藝，楊新筍，何靜仁,*

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北省農業科學院糧食作物研究所，湖北 武漢 430064）

紫薯（Ipomoea batat Poir.）又名黑薯，薯肉呈紫色至深紫色，屬旋花科一年生草本植物。紫薯中富含花色苷類色素、蛋白質、多糖、硒、淀粉、果膠、纖維素和礦物質等多種營養成分[1]，具有抗氧化[2]、抗癌[3]、降血糖[4]、降血壓[5]等生理功效。國內外諸多學者對紫薯中的營養物質進行了研究，其中花色苷由于具有潛在的健康益處而受到廣泛關注。

在自然狀態下，植物組織中的花色苷非常穩定，日照、溫度等對其幾乎沒有影響[6]。但是在純化、加工及貯藏過程中，花色苷的穩定性易受溫度、pH值、光照、抗壞血酸、氧氣等因素的影響，導致花色苷降解，引起食品色澤的變化，造成食品品質的下降[7-8]。目前關于熱處理、pH值、光照等因素對花色苷影響的研究較多，Li Jie等[9]研究了pH 2～6紫薯花色苷水溶液分別在80～100 ℃熱處理條件下花色苷的降解情況，發現紫薯花色苷的降解速率隨著溫度的升高而增加，并且在相同溫度下，pH 3的樣品降解速率最慢。Li Jing等[10]研究表明添加抗壞血酸可以增加貯藏過程中紫薯花色苷的降解速率。目前這些研究主要集中于定量分析總花色苷的降解規律，而關于各單體花色苷的降解情況研究較少。為了進一步理解紫薯花色苷的降解特性，有必要研究各單體花色苷的降解規律及降解反應過程中發生的其他反應。本實驗主要利用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法對紫薯花色苷的成分進行鑒定分析，并研究紫薯花色苷在不同溫度下貯藏98 d期間總花色苷和各單體花色苷的降解情況以及褐變指數和聚合物顏色指數的變化情況，以期為食品中花色苷的穩定化控制提供有利的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯品種為‘鄂薯12號’，由湖北省農科院糧食作物研究所提供。

磷酸氫二鈉、檸檬酸、鹽酸、氯化鉀、乙酸、乙酸鈉、偏重亞硫酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；AB-8型大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜純） 美國Tedia公司。

1.2 儀器與設備

VM0109食物攪拌器 美國Vitamix公司；JE2002電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；AL204電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；STARTER 3100 pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TGCXZ-10B超聲逆流循環提取機 北京弘祥隆生物技術股份有限公司；TGL205高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；Evolution 220紫外-可見分光光度計、Accela-LTQ XL HPLC-MS/MS儀 美國Thermo Fisher公司；ALPHA 2-4 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；R-3旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯花色苷的提取純化

紫薯洗凈后切塊，加入適量蒸餾水，用食物攪拌器打漿，按料液比1∶8加入體積分數60%乙醇-鹽酸溶液（pH 4.0）攪勻，40 ℃超聲輔助提取90 min，4 000 r/min條件下離心20 min，得到含有花色苷的上清液，37 ℃條件下減壓濃縮除去乙醇，得到富含花色苷的濃縮液。選用已處理的AB-8大孔吸附樹脂對紫薯花色苷進行動態吸附-解吸[11]，上樣流速為3～4 BV/h，吸附飽和后，用蒸餾水洗滌，去除花色苷中的蛋白質、糖類、有機酸等雜質，再用體積分數70%乙醇溶液以1～2 BV/h流速進行解吸，洗脫得到的溶液于37 ℃條件下減壓濃縮除去乙醇，得到純化的花色苷，于-20 ℃下冷凍，后轉入冷凍干燥機中冷凍干燥，得到花色苷含量為37.2 mg/g的紫薯花色苷粉末。

1.3.2 紫薯花色苷的結構鑒定

1.3.2.1 HPLC條件

根據Li Jie等[9]的方法稍作改動，進行HPLC-MS/MS分析。色譜柱：反相C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為體積分數10 %甲酸水溶液，B相為甲酸-乙腈（10∶90，V/V）溶液；線性梯度洗脫：0～60 min，6%～22% B；60～66 min，22%～30% B；66～68 min，30%～90% B；68～72 min，90% B；72～74 min，90%～6% B；74～80 min，6% B；流速1 mL/min；柱溫25 ℃：進樣量10 μL；檢測波長525 nm；二極管陣列檢測器。

1.3.2.2 MS條件

電噴霧離子源；正離子掃描；質量掃描范圍m/z 500～2 000；N2流速20 L/min；毛細管電壓26 V；毛細管溫度270 ℃。

1.3.3 紫薯花色苷溶液的貯藏

稱取一定量的紫薯花色苷凍干粉，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 3.0）配成8 g/L的花色苷溶液，巴氏滅菌后在超凈工作臺分裝，置于4、20、35 ℃避光貯藏，分別取0、7、14、21、28、35、42、49、53、63、70、77、84、92、98 d時的紫薯花色苷溶液，用于各項指標的測定。

1.3.4 總花色苷含量的測定

采用pH示差法測定黑豆花色苷含量[12]。0.3 mL樣品分別用pH 1.0 HCl-KCl（取0.2 mol/L KCl溶液25 mL、0.2 mol/L HCl溶液67 mL定容至100 mL）和pH 4.5 CH3COOH-CH3COONa（取CH3COONa 1.8 g、CH3COOH 0.98 mL定容至100 mL）緩沖液稀釋，在最大吸收波長λmax和700 nm波長處測定吸光度。總花色苷含量按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計，按公式（1）計算總花色苷含量。

式中：C為總花色苷含量/（mg/g）；Ab＝（Aλmax-A700nm）pH1.0-（Aλmax-A700nm）pH4.5；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數（26 900 L/（mol·cm））；L為比色皿寬度（1 cm）；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量（449.2 g/mol）；D為稀釋倍數；V為樣品體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.5 聚合物顏色的測定

采用偏亞硫酸氫鹽漂白方法測定聚合物顏色指數[13-14]。0.5 mL樣品用pH 2.2磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（取0.2 mol/L磷酸氫二鈉4.0 mL、0.1 mol/L檸檬酸106.0 mL混合至110.0 mL）稀釋至10 mL。取4 mL稀釋后的樣品分別加入1 mL偏亞硫酸氫鈉（1 mol/L）和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 2.2）平衡40 min后，測定最大吸收波長λmax、420 nm和700 nm波長處吸光度，按公式（2）計算聚合物顏色指數。

式中：聚合物顏色＝（A420nm-A700nm）+（Aλmax-A700nm）×稀釋倍數，其中A是與偏亞硫酸氫鈉混合的樣品在特定波長處獲得的吸光度；顏色密度＝（A420nm-A700nm）+（Aλmax-A700nm）×稀釋倍數，其中A是與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混合的樣品在特定波長處的吸光度。

按公式（3）計算褐變指數。

式中：A是與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混合的樣品在特定波長處的吸光度。

1.3.6 HPLC測定單個花色苷含量變化

HPLC條件同1.3.2.1節。根據液相圖譜峰面積變化進行降解動力學分析。

1.3.7 降解動力學分析

研究表明可運用一級反應動力學模型分析花色苷的熱降解[13,15-16]。按公式（4）、（5）計算一級反應速率常數（k）和半衰期（t1/2）。

式中：Ct為貯藏t/d時花色苷的含量/（mg/g）；C0為0 d時花色苷的含量/（mg/g）。花色苷單體實驗中，C0和Ct分別為初始時刻和貯藏t/d后各單體花色苷在525 nm檢測波長下的色譜峰面積。

溫度對降解速率的影響主要與動力學常數相關，熱降解活化能Ea/（kJ/mol）可根據Arrhenius方程（式（6））計算得出。

式中：k0為頻率常數/m i n-1；R為氣體常數（8.314 J/（mol·K））；T為處理溫度/K。

根據方程（7）、（8）和（9）分別計算各溫度下的焓變（△H/（kJ/mol））、吉布斯自由能（△G/（kJ/mol））和熵（△S/（kJ/mol））[13]。

式中：Ea是活化能/（kJ/mol）；h是普朗克常數（6.626 2×10-34J·s）；kB是玻爾茲曼常數（1.380 6×10-23J/K）；T為絕對溫度/K；k為降解速率/d-1。

1.4 數據統計分析

實驗結果以平均值±標準差表示，動力學擬合采用Origin 2016軟件進行線性擬合。數據顯著性差異使用Duncan’s和最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進行分析。

2 結果與分析

2.1 紫薯花色苷的結構鑒定

紫薯中含有豐富的花色苷類物質，通過HPLC-MS/MS分析，共分離出17 種化合物，與文獻[9,17-19]數據比較，最終鑒定了13 種化合物，由于其他峰相對強度小而未具體分析。所得HPLC圖譜見圖1，鑒定出的13 種化合物質譜數據見表1。

紫薯花色苷提取物中的花色苷含有矢車菊素和芍藥素兩種苷元，且與葡萄糖和槐糖共軛形成糖基化。紫薯花色苷多數為酰化花色苷，與咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸結合成單酰基花色苷和二酰基花色苷，且矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡糖苷和芍藥素-3-槐糖苷-5-葡糖苷是其他酰化花色苷的基本結構。該結論與Li Jie[9]和Liu Xingli[17]等的研究結果一致。另外，本研究鑒定出的13 種結構與Xu Jianteng[18]和Kim[19]等的研究結果存在一些差異，這可能是由于品種不同導致花色苷的組分存在差異。

圖1 紫薯花色苷提取物的HPLC圖Fig. 1 HPLC profile of purple sweet potato anthocyanin extract

表1 紫薯提取物中主要花色苷化合物的質譜數據Table 1 Mass spectral data for the predominant anthocyanin compounds in purple sweet potato extract

2.2 紫薯花色苷提取液貯藏過程中總花色苷的降解動力學

圖2 紫薯提取液貯藏過程中總花色苷含量變化（A）和其降解動力學（B）Fig. 2 Changes (A) and degradation kinetics (B) of anthocyanins in purple sweet potato extract during storage at different temperatures

表2 紫薯提取液在不同溫度下總花色苷動力學參數Table 2 Kinetic parameters of total anthocyanins in purple sweet potato at different temperatures

溫度是影響花色苷穩定性的一個重要因素，溫度對花色苷的降解有顯著影響[20-22]。由圖2A可知，紫薯花色苷隨貯藏時間和貯藏溫度的變化發生不同程度降解，花色苷隨著貯藏時間的延長不斷發生降解反應，貯藏溫度越高，降解速率越快。貯藏98 d后，4、20 ℃和35 ℃花色苷溶液的殘留率分別為77.2%、24.1%和12.3%。結果表明總花色苷的降解隨著貯藏溫度的升高明顯增強，低溫條件下貯藏有利于紫薯花色苷的穩定。

趙玉紅[23]和Cisse[24]等的研究表明在貯藏過程中花色苷的降解符合一級反應動力學模型特征。圖2B和表2表明，在本研究中各溫度下紫薯總花色苷的降解也符合一級反應動力學模型特征（R2＞0.95）。總花色苷的降解速率常數和半衰期受貯藏溫度的影響，貯藏溫度越高，紫薯花色苷的降解速率越大，同時伴隨著半衰期逐漸縮短。4 ℃時紫薯總花色苷的降解速率為3.03×10-3d-1，半衰期為228.8 d，明顯低于35 ℃時的降解速率21.28×10-3d-1，長于35 ℃時的半衰期32.6 d。Li Jing等[10]的研究表明，紫薯花色苷在pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，70～90 ℃熱處理條件下總花色苷的半衰期為29.4～21.7 h。Li Jie等[9]的研究表明，紫薯花色苷水溶液在pH 3.0、80～100 ℃熱處理條件下總花色苷的半衰期為96.3～12.6 h。這些研究結果與本實驗結果相似，溫度越高，花色苷降解速率越快。吳文麗等[1]報道，紫薯酒在5、25 ℃和37 ℃貯藏條件下，總花色苷的半衰期分別為9 902、1 732 d和59 d，明顯比本實驗中紫薯花色苷的半衰期長，可能是由于花色苷溶液的體系不同對花色苷的穩定性有不同的影響，或者花色苷的種類差異性影響其穩定性。

活化能通常用來描述分子從常態轉變為容易發生化學反應的活躍狀態所需的能量[25]。通過使用Arrhenius模型，得到紫薯花色苷的活化能Ea為45.2 kJ/mol。Li Jie等[9]報道，紫薯花色苷的活化能為66.56～111.57 kJ/mol，本研究活化能低于其結果，高于Li Jing等[10]報道的紫薯花色苷活化能16.46 kJ/mol，這可能與紫薯的品種和花色苷溶液的體系不同有關。

熱力學參數可以深入解釋熱降解反應中發生的物理和化學現象。表3顯示了不同貯藏溫度下花色苷降解的焓（ΔH）、吉布斯自由能（ΔG）和熵（ΔS）的變化。ΔH表示反應物和活化絡合物之間的能量差，它與反應物化學鍵的強度有關[13,26]。如表3所示，在4～35 ℃貯藏溫度下，紫薯花色苷降解的ΔH為55.0～55.3 kJ/mol，這表明一定范圍內的溫度變化對紫薯花色苷降解的ΔH影響較小。表中ΔH都是正值，表明花色苷降解反應為吸熱反應[13,26-27]，同時證明了溫度越高，花色苷降解速率越快。ΔG代表反應物的能量和活化狀態之間的差異，通常被當作過程自發性的標準[13,26]。在4～25 ℃貯藏溫度下，紫薯花色苷降解的ΔG都是正值（107.2～114.5 kJ/mol），這表明花色苷降解是非自發反應[13,26]。ΔS表示反應體系中分子無序的變化，它通常與具有可以實際反應能量的分子數量有關[13,26]。在本研究中ΔS均為負值（-193.0～-186.2 kJ/mol），表明活化絡合物的結構自由度低于反應物[13,26]。且在研究溫度范圍內ΔS值非常接近，表明溫度變化對花色苷降解的ΔS影響較小。

表3 紫薯花色苷在不同溫度下熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters of anthocyanins in purple sweet potato at different temperatures

2.3 紫薯花色苷提取液貯藏過程中單體花色苷的降解特性

為深入研究紫薯提取液在貯藏過程中花色苷的降解規律，對各單體花色苷進行一級動力學模擬研究。紫薯提取液在貯藏過程中12 種單體花色苷的動力學參數如表4所示，各單體花色苷的降解符合一級反應動力學模型特征。隨著貯藏溫度的升高，花色苷降解的速率常數增加，半衰期也相應地縮短。速率常數結果表明花色苷的穩定性隨著溫度的升高而降低。矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡糖苷和芍藥素-3-槐糖苷-5-葡糖苷兩種未酰化的花色苷在4 ℃時的半衰期分別為123.3 d和135.1 d，明顯長于在20 ℃和35 ℃貯藏時的半衰期，這說明貯藏溫度是影響花色苷降解的主要原因。此外，研究發現矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡糖苷和芍藥素-3-槐糖苷-5-葡糖苷兩種未酰化的花色苷的半衰期比相對應酰基化的花色苷的稍短，說明酰基化花色苷較為穩定[8,28]；同時，二酰基花色苷的半衰期稍長于相對應的單酰基花色苷的半衰期，如在35 ℃貯藏條件下，矢車菊素-3-(6’-咖啡酰-6’對羧基苯甲酰槐糖苷)-5-葡糖苷的半衰期為33.4 d，長于矢車菊素-3-對羧基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷的半衰期22.7 d和矢車菊-3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷的半衰期31.3 d。另一方面，從表4中可以看出，在糖苷相同的情況下，矢車菊素的半衰期要短于芍藥素，這可能是因為矢車菊素較芍藥素多一個羥基，從而更易被氧化。表明花色苷的穩定性可能與其本身的羥基相關[8,25]。對于各單體花色苷的降解，不同的文獻稍有差異。這些差別可能與實驗原料品種或實驗條件有關。在本實驗中，在20 ℃和35 ℃貯藏溫度下，總花色苷的半衰期分別為48.1 d和32.6 d，和單體花色苷的半衰期差別不明顯。但是，在4 ℃貯藏溫度下總花色苷的半衰期228.8 d，長于大部分單體花色苷的半衰期，究其原因，可能是因為在紫薯中還含有少量未檢測出的酰基化花色苷，在較低貯藏溫度下降解緩慢。

表4 紫薯提取液在不同溫度下單個花色苷動力學參數Table 4 Kinetic parameters for indvidual anthocyanins in purple sweet potato at different temperatures

2.4 紫薯花色苷提取液貯藏過程中聚合物顏色指數的動力學

圖3 紫薯提取液貯藏過程中花色苷褐變指數（A）、聚合物顏色指數（B）、花色苷含量與聚合物顏色指數之間的關系（C）Fig. 3 Browning index (A), polymeric color (B) and correlation between anthocyanin content and polymeric color (C) of anthocyanins in purple sweet potato extract during storage

表5 紫薯花色苷在不同溫度下褐變指數形成和聚合物顏色指數形成的動力學參數Table 5 Kinetic parameters for browning index and polymeric color index of purple sweet potato anthocyanins at different temperatures

花色苷的降解致使最大吸收波長處吸光度減小，而花色苷降解過程中結構的分解產生褐變，引起420 nm波長處吸光度的增加。因此褐變指數可以作為花色苷降解的考察依據[15]。不同貯藏溫度下紫薯花色苷褐變指數的變化如圖3A所示，褐變指數隨著貯藏溫度的升高和貯藏時間的延長而增大。如在貯藏時間為42 d時，4、20 ℃和35 ℃花色苷溶液的褐變指數分別為0.28、0.31和0.37，而在貯藏時間為92 d時，4、20 ℃和35 ℃花色苷溶液的褐變指數分別為0.30、0.44和0.65。由表5可知，4、20 ℃和35 ℃貯藏條件下花色苷褐變指數形成的速率常數分別為3.31×10-4、17.12×10-4d-1和36.22×10-4d-1。表5表明在貯藏過程中褐變指數形成的動力學符合零級反應模型（R2＞0.83）。Sinela等[15]在玫瑰茄提取物中同樣發現隨著溫度的升高和貯藏時間的延長，花色苷的褐變指數隨之增大。

聚合物顏色指數是指聚合物顏色與顏色密度之比。在紫薯花色苷提取物貯藏過程中聚合物顏色指數顯著增加（P＜0.05）。圖3B和表5表明在各溫度下紫薯中聚合物顏色指數的形成符合零級反應動力學模型特征（R2＞0.88）。4、20 ℃和35 ℃貯藏條件下花色苷聚合顏色形成的速率常數分別為2.95×10-4、18.41×10-4d-1和29.31×10-4d-1。與花色苷降解相似，聚合物顏色形成的速率常數隨著溫度的升高而增加。在貯藏過程中，聚合物顏色形成逐漸增加可能是由各種反應造成，比如花色苷的降解反應、花色苷的聚合反應以及由還原糖和氨基酸之間的非酶促褐變反應產生絡合物與類黑色素顏料[15,21]。在這些反應中，最可能的反應之一是花色苷的降解。如前所述，花色苷降解的速率隨著溫度的升高而增加。花色苷降解的同時伴隨著聚合物顏色指數的增加[15,29]。圖3C顯示，紫薯花色苷提取液在貯藏過程中花色苷含量（C/（mg/g））與聚合物顏色指數之間呈負相關關系，可用指數關系表示：聚合物顏色指數＝0.081 9+0.525 0×e-0.1187C（R2＝0.98）。

本研究結果與Martynenko等[13]研究藍莓汁中花色苷含量與聚合物顏色指數關系的結果一致。紫薯提取液在貯藏期間聚合物顏色增加的第二個最可能的原因是花色苷之間，或者花色苷與其他（非）酚類物質發生縮合反應形成聚合物。

圖4 紫薯提取液在不同貯藏溫度下的呈色情況Fig. 4 Color of purple sweet potato extract at different storage temperatures

由圖4可知，在同一貯藏溫度下，隨著貯藏時間的延長，紫薯提取液的顏色變化不明顯。究其原因，可能是‘鄂薯12號’中含有多酰基化花色苷，而這類花色苷結構的特異性使樣品具有色澤保持性。這同時表明花色苷之間，或者花色苷與其他（非）酚類物質可能發生縮合反應形成聚合物使樣品具有色澤保持性。因此，需要深入研究花色苷本身或與其他酚類化合物的縮合反應，鑒定花色苷聚合物并確定其體內生物利用度。Sinela[15]和Türkyilmaz[21]等的研究同樣發現在貯藏過程中花色苷之間，或者花色苷與其他（非）酚類物質發生縮合反應形成聚合物。

3 結 論

通過研究不同貯藏溫度對紫薯總花色苷和各單體花色苷含量變化的影響，模擬動力學模型，分析紫薯總花色苷和各單體花色苷的降解情況以及褐變指數和聚合物顏色指數變化情況，探索紫薯花色苷變化規律，這將有助于抑制貯藏過程中紫薯提取物中花色苷的降解，為紫薯加工產品的花色苷降解提供理論依據，具體得出以下結論：

紫薯中含有豐富的花色苷類物質，通過HPLC-MS/MS分析鑒定出13 種主要的花色苷類化合物。

紫薯提取液在4、20 ℃和35 ℃貯藏條件下，總花色苷和各單體花色苷的降解符合一級動力學模型，且溫度越高，花色苷的降解速率越快，半衰期t1/2越短；在糖苷相同的情況下，矢車菊素的半衰期要短于芍藥素；在相同花色素配體情況下，酰基化花色苷的半衰期要長于未酰基化花色苷，且二酰化花色苷的半衰期長于單酰化花色苷；通過熱力學分析表明熱降解反應為吸熱非自發反應。

花色苷褐變指數和聚合物顏色指數隨貯藏時間的延長和貯藏溫度的升高而增大，并且聚合物顏色指數與花色苷含量之間呈指數關系。