超高壓條件下亞麻籽膠對豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

劉 旺，馮美琴，孫 健,*，徐幸蓮，周光宏

（1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.金陵科技學院動物科學與技術學院，江蘇 南京 210038）

隨著經濟的發展以及人們生活水平的提高，人們的飲食結構早已發生了巨大的變化，從以植物性食物為主轉變成以肉類食品為主[1]。與此同時，隨著機械行業和食品加工技術的崛起，越來越多種類的肉制品（如腸類、肉糜類等重組肉制品）出現在人們的生活中。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉中一類具有重要生物學功能的結構蛋白群[2]，在肌肉蛋白質中占50%～55%。MP是形成凝膠的主要成分[3]，與肉制品的質構、保水性、流變性等特性密切相關[4]。為了改善肉制品及其凝膠類肉品品質，通常添加一些具有增稠、保水等性質的多糖，如卡拉膠[5]、膳食纖維[6]，以改善其品質。亞麻籽膠（f l axseed gum，FG）是亞麻油工業的副產品，是水溶性的陰離子多糖，通常表現出弱的凝膠狀特性，在加熱過程中形成熱可逆凝膠[7]，具有美容、防癌、降低糖尿病和心臟病發病率的保健功效[8]。這些優越的性質使其可以替代卡拉膠、膳食纖維等應用于肉制品中。有研究表明，FG的添加可以顯著改善產品品質。孫曉冬等[9]研究FG在肉腸中的應用，結果顯示其可以顯著改善肉腸加工品品質和復水性。Sun Jian等[10]發現，添加FG可顯著提高MP的凝膠保水性。潘麗華等[11]研究不同溫度下FG對MP凝膠特性的影響，結果發現FG改善了MP凝膠的保水性，但顯著降低了其凝膠強度。

除了添加物和理化條件影響肉制品品質外，一些新型加工處理方式對肉制品品質也有顯著地改善作用，其中超高壓處理就是一種常用方法。在肉制品開發中，將超高壓與多糖添加劑結合已廣受關注。Yang Huijuan等[12]單獨使用高壓技術或與多糖添加劑結合，生產出符合人類健康需求的低脂肉制品。Chen Xin等[13]發現高壓處理可以顯著提升海藻酸鈉-肌動球蛋白凝膠強度，并改善了其凝膠特性。這些都為應用超高壓處理改善肉制品凝膠特性提供參考。然而，不同壓力下FG與MP相互作用以及對最終熱凝膠特性的影響鮮有報道。本實驗對不同壓力下添加FG對MP分子間作用力、凝膠特性以及微觀結構的影響進行研究，以期為更好地利用FG、肉制品的開發和凝膠類產品品質改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌 江蘇省食品集團；FG 新疆綠旗企業（集團）生物科技有限公司；1-苯胺基萘-8-磺酸（1-aniline naphthalene-8-sulfonic acid，ANS）、雙縮脲、牛血清白蛋白、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 南京化學試劑設備有限公司；K2HPO4·3H2O、KH2PO4、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA） 國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛、氯化鈉 阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Avanti J-E離心機 美國Beckman Coulter公司；Ultra Turrax T-25 Basic高速勻漿機 德國IKA公司；TA.XT plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；M2e多功能酶標儀 美國MD公司；MesoMR核磁共振儀 上海紐曼公司；MCR301界面流變儀 奧地利Anton Paar公司；S-IL-100-850-9-W高壓設備 英國Stansted Fluid Power公司；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參照Han Minyi等[14]的方法并適當改進，所有操作環境溫度均為4 ℃。背最長肌剔除肉眼可觀察到的脂肪，稱取80 g，用絞肉機攪碎3 次（3 s/次）。加入4 倍體積的提取液（0.1 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA，pH 7.0），冰浴勻漿30 s，重復兩次。將分散好的樣品用紗布過濾，2 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清液。加入4 倍體積的提取液和質量分數0.5% Triton X-100，冰浴勻漿，雙層紗布過濾后2 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清液收集沉淀。重復第1步操作，取沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L KCl鹽溶液重新分散沉淀，2 000×g、4 ℃離心10 min，棄去上清液收集沉淀。重復兩次，最后所得沉淀即為純化的MP，采用雙縮脲法測定MP質量濃度，保存于4 ℃冰箱待用。

1.3.2 不同壓力MP-FG混合物的制備

參照Chen Xin等[5]的方法將MP質量濃度調成50 mg/mL，FG質量分數為0.3%，充分混勻。分別以壓力水平為0.1、100、200、300、400 MPa處理MP-FG混合體系，在同一壓力水平下以不加FG的MP作為對照。

1.3.3 動態流變性的測定

參照Li等[15]的方法并作修改，采用50 mm平行板，將MP和MP-FG樣品均勻涂布在測試臺并趕走氣泡。測試頻率為1 Hz，狹縫距離為1 mm，應變力為1%。溫度程序為從20 ℃以2 ℃/min升溫至80 ℃。為了防止升溫過程水分蒸發，用石蠟封平行板與空氣接觸的外沿。每個樣品3 個平行。

1.3.4 凝膠的制備

參照Zhang Ziye等[16]的方法并作修改，將制備好的MP與MP-FG加入10 mL小燒杯并置于水浴鍋，以2 ℃/min從20 ℃上升到80 ℃，并在80 ℃保持20 min。結束后迅速用冰水冷卻，保存在4 ℃冰箱平衡過夜后進行各指標的測定。

1.3.5 保水性的測定

參照Chen Xin等[5]的方法并作適當修改，取3 g凝膠樣品于離心管中，4 ℃條件下10 000×g離心10 min，用濾紙吸取離心后的水分，稱質量。保水性按公式（1）計算。

式中：m0為離心管質量/g；m2為離心后樣品和離心管的質量/g；m1為離心前樣品和離心管的質量/g。

1.3.6 凝膠強度的測定

參照Xue Siwen等[17]的方法并作適當修改，將制備好的凝膠直接放在10 mL小燒杯中，采用TA.XT plus質構儀測定。參數設定：使用P/5型號探頭，測前速率為2 mm/s，測試速率為1 mm/s，測試距離設為4 mm，觸發力設為3 g。每個樣品作3 個平行。

1.3.7 活性巰基含量的測定

活性巰基含量的測定參照Guo Xiuyun等[18]的方法并加以修改。用磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋至1 mg/mL，取5 mL樣品加到10 mL離心管中，再加入20 μL DTNB，振蕩均勻后25 ℃反應1 h。反應結束后在412 nm波長處測吸光度，活性巰基含量計算如公式（2）所示。

式中：C0為活性巰基含量/（mol/g）；A為412 nm波長處吸光度；ε為摩爾消光系數（13 600 L/（mol·cm））；D為稀釋倍數；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 疏水性的測定

參考Zhang Ziye等[19]的方法并加以修改，采用疏水探針結合法測定。用磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl、pH 7.0）將樣品稀釋至1 mg/mL，取4 mL樣品，加入20 μL 15 mmol/L ANS（pH 7.0），混勻后于黑暗處25 ℃孵育20 min。反應結束后，在激發波長375 nm、發射波長460 nm條件下測定其熒光強度以表示其疏水性。

1.3.9 低場核磁共振法對水分分布的測定

參照Han Minyi等[20]的方法并加以修改。取2 g凝膠樣品置于直徑25 mm的核磁小管中，使用CPMG序列進行測定，質子共振頻率為22.6 MHz。測試參數為：回波時間為200 μs，重復掃描32 次，間隔時間為6 500 ms，回波數12 000 個。其數據利用儀器自帶的Multi-Exp Inv Analysis軟件進行反演，得到對應的峰面積所占比例。

1.3.10 微觀結構觀察

參照Cao Yingying等[21]的方法并作適當修改。將凝膠切成約2 mm正方體，放入質量分數2.5%戊二醛溶液固定制樣，再用不同體積分數乙醇進行梯度脫水。將處理后的樣品放入超臨界點干燥儀中干燥、噴金后用掃描電子顯微鏡觀察并拍照，加速電壓為5 kV，放大2 000 倍。

1.4 數據處理

每個樣品至少3 次重復實驗，用SAS 8.1軟件對實驗數據進行分析，采用鄧肯氏多重比較法，差異顯著性采用t檢驗進行比較，并用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同壓力下FG對MP保水性的影響

圖1 不同壓力下FG對MP凝膠保水性的影響Fig. 1 Effect of fl axseed gum on WHC of myofibrillar protein gel at different pressures

保水性是肉制品熱誘導凝膠重要的功能特性之一，對肉的嫩度、顏色等感官指標有著直接的影響。從圖1可以看出，經100～200 MPa處理后，對照組MP凝膠的保水性從65.1%顯著上升至81.5%（P＜0.05）。隨著壓力升高到300 MPa，MP凝膠的保水性從81.5%降低至75.2%（P＜0.05）。當壓力從300 MPa上升至400 MPa時，MP凝膠保水性變化不顯著（P＞0.05）。He Xuanhui等[22]發現大豆分離蛋白在0.1～200 MPa條件下凝膠保水性隨著壓力增大而增加，這與本研究結論一致。壓力過高使蛋白質發生變性，從而降低MP溶解度[7]。在加熱過程中，變性的MP無法保留更多的水分，導致凝膠保水性下降。相比于對照組，添加FG后凝膠保水性在0.1～400 MPa壓力下均顯著提高（P＜0.05）。經200 MPa處理后，MP-FG的保水性從91.2%上升至最大值95.8%（P＜0.05）。總體來說，MP-FG凝膠保水性隨著壓力的增大而增加，該結果和不同壓力（100～300 MPa）處理海藻酸鈉與豬肉凝膠的結果類似[23]。其原因可能是FG具有較弱的凝膠性，可以存在于蛋白凝膠網絡空隙中，起到填充持水的作用。另一方面，FG屬于陰離子多糖[6]，大量帶負電的多糖與帶正電的蛋白質側鏈基團相互作用，提高了MP凝膠保水性。隨著壓力的增大，MP疏水基團、巰基等基團暴露，這些基團與FG產生交互作用，最終也導致了MP-FG凝膠體系保水性的提高。

2.2 不同壓力下FG對MP凝膠強度的影響

圖2 不同壓力下FG對MP凝膠強度的影響Fig. 2 Effect of fl axseed gum on gel strength of myofibrillar protein at different pressures

凝膠強度是凝膠質構的重要指標，關系著肉制品加工質量。從圖2可以看出，在未添加FG條件下，MP經100～400 MPa高壓處理后，能顯著降低其凝膠強度（P＜0.05）；經100、200 MPa處理的MP凝膠強度變化不明顯。類似的結果也出現在經超高壓（100～600 MPa）處理的肌球蛋白凝膠[24]，高壓能夠使蛋白變性展開，從而使更多的水分子進入，降低了凝膠強度[5]。在0.1、100 MPa壓力下，添加FG均顯著降低了MP的凝膠強度（P＜0.05），同樣的結果也出現在不同加熱溫度FG對MP凝膠強度影響的研究中，溫度達到80 ℃時，添加FG顯著降低了MP凝膠強度[11]。當壓力大于200 MPa后，MP-FG凝膠強度顯著高于MP凝膠（P＜0.05），這與200 MPa處理提高了添加質量分數0.75%海藻酸鈉的豬肉糜凝膠強度結果[23]相似。隨著壓力繼續增大，MP-FG凝膠強度逐漸降低（P＜0.05）。這是因為壓力增大使蛋白質與多糖之間相互作用增強，形成聚合物，在蛋白質加熱時抑制蛋白質變性，從而降低了MP-FG凝膠強度[25]。

2.3 不同壓力下FG對MP凝膠流變特性的影響

圖3 不同壓力下FG對MP凝膠流變特性的影響Fig. 3 Effect of fl axseed gum on rheological properties of myo fibrillar protein gel at different pressures

儲能模量（G′）表示流體的彈性，在凝膠形成過程中反映凝膠強度[21]。由圖3可以看出，當壓力小于200 MPa時，MP與MP-FG凝膠在43～50 ℃范圍內均出現明顯的熱變性峰。此階段開始形成較為疏松的凝膠結構。出現第1個峰普遍接受的解釋為肌球蛋白頭部受熱部分變性接合，從而導致了G′上升。而50～60 ℃時，G′急劇下降，肌球蛋白進入凝膠減弱階段。這個階段主要是因為肌球蛋白尾部打開，增加了體系的流動性，最終導致G′急劇下降。60～80 ℃時，G′隨著溫度的升高穩步上升，在60 ℃以后肌球蛋白充分變性展開，與現有的結構交聯數量增加，形成不可逆凝膠[6]。損耗模量（G′′）反映流體黏性的大小，變化趨勢和G′基本一致。

從整體上看，添加FG并不會改變G′曲線的形狀。且隨著壓力的增大，MP和MP-FG凝膠的G′與G′′逐漸降低，這是因為高壓可以改變疏水作用和二硫鍵等作用力，從而影響體系的流變特性，宏觀上表現出黏度的變化。添加質量分數0.3% FG提高了MP在對應壓力下的G0′與G0′′（分別為20 ℃（起始溫度）時的G′和G′′），這是因為FG與膠體相互作用使樣品黏度增大，類似的結果也出現在肌動球蛋白-海藻酸鈉混合體系中[13]。100～200 MPa條件下，MP和MP-FG凝膠加熱過程中存在明顯熱特性峰；而300～400 MPa時，G′與G′′隨溫度的增加而增加，原有的特征峰變得不明顯甚至消失，表明蛋白質已經發生了變性。當壓力達到200 MPa后，G0′與G0′′急劇下降，說明高壓導致了體系流動性增加和黏度變小。在0.1、100 MPa時，添加FG顯著降低了MP在40～80 ℃時的G′和G′′。然而，當壓力大于200 MPa時，MP-FG凝膠的G′與G′′高于MP凝膠，這與凝膠強度的結果吻合。

2.4 不同壓力下FG對MP凝膠水分狀態的影響

圖4 不同壓力下添加FG對MP凝膠弛豫時間（T2）的影響Fig. 4 Effect of fl axseed gum on T2 relaxation time of myofibrillar protein gel at different pressures

由于低場核磁共振能夠進行無損檢測，可以了解水分子中氫質子的移動和分布，越來越多地被應用于肉和凝膠制品的保水性分析中。由圖4可知，通過對弛豫時間T2進行指數擬合，出現了3 個部分。它們對應的時間分別為T2b（1～10 ms）、T21（100～1 000 ms）和T22（1 000～4 328 ms），這與前人的研究結果[26]相似，分別對應與蛋白分子結合最為緊密的結合水（T2b）、具有弱流動性的不易流動水（T21）和中度可移動的自由水（T22），其對應的峰面積所占比例分別記為PT2b、PT21和PT22。

表1 不同壓力下FG對MP凝膠各弛豫峰峰面積比例的影響Table 1 Effect of fl axseed gum on the proportion of relaxation peak areas of myofibrillar protein gel under different pressures

由表1可知，常壓下，添加FG顯著增加了PT2b和PT21，降低了PT22（P＜0.05）。說明添加FG顯著降低了自由水比例，自由水比例降低導致了凝膠保水性的增加。壓力上升到200 MPa時，MP與MP-FG凝膠的PT21均升高，而PT22降低。這表明適當的壓力可以使凝膠網絡更加致密，最終導致自由水向不易流動水轉化。當壓力大于200 MPa時，MP與MP-FG凝膠的PT2b、PT21下降，PT22上升，這與Xue Siwen等[27]研究高壓對兔肉凝膠水分影響的結果一致。300、400 MPa條件下，添加FG的MP凝膠PT21顯著高于對照組，PT22低于對照組，這與保水性的變化趨勢基本保持一致，說明不同壓力下，FG可以提高MP凝膠中不易流動水的比例，同時降低自由水比例，從而提高其保水性。

2.5 不同壓力下FG對MP凝膠疏水性的影響

圖5 不同壓力下FG對MP凝膠疏水性的影響Fig. 5 Effect of fl axseed gum on hydrophobicity of myofibrillar protein gel at different pressures

疏水性的變化可以反映蛋白質三級結構的變化，蛋白質三級結構的變化可以暴露出疏水基團，影響蛋白凝膠的形成[28]。ANS熒光探針可以結合疏水基團產生強烈的熒光，是目前研究疏水作用力的常用方法。由圖5可知，常壓下，添加FG顯著增加了MP的疏水性（P＜0.05）。MP和MP-FG凝膠疏水性均隨著壓力的升高而升高。當壓力升至200、300 MPa時疏水性增加幅度較大，這與前人的研究結果[19]類似。這可能是因為較低的壓力無法使蛋白質內部疏水基團充分暴露，隨著壓力的增加，更多的疏水基團暴露出來，從而提高了MP和MP-FG凝膠的疏水作用[29]。當壓力達到400 MPa時，MP和MP-FG凝膠的疏水性不再增加。隨著壓力的進一步增大，蛋白質分子間聚集程度變大，暴露出來的疏水基團被包埋，使得ANS無法與更多的疏水基團結合，進而導致疏水性的飽和[19]。疏水作用被認為是形成肌球蛋白聚集的先決條件，促進凝膠的形成和多糖與蛋白的相互作用，最終改善凝膠的特性[5]。凝膠的形成是多種作用力作用的結果，疏水基團的過度暴露可能破壞不同作用力之間的平衡，引起凝膠保水性的下降[30]。

2.6 不同壓力下FG對MP凝膠活性巰基含量的影響

巰基具有很強的還原力，活性巰基指的是暴露在蛋白質表面的巰基。在加熱過程中巰基可以形成二硫鍵，對蛋白質功能特性有關鍵影響[31]。從圖6中可以看出，壓力達到100 MPa時并不能引起活性巰基含量的顯著變化（P＞0.05），同樣的現象出現在100 MPa處理肌動球蛋白-海藻酸鈉混合體系中[7]。這可能是由于壓力太小，無法使蛋白質內部巰基暴露。隨著壓力的增大（100～300 MPa），活性巰基含量整體呈上升趨勢，且壓力從100 MPa升至200 MPa時活性巰基含量變化幅度較大（P＜0.05），這與疏水性的變化基本一致。這說明壓力的升高使得蛋白質變性展開，埋在蛋白內部的巰基暴露到表面[29]。當壓力上升至400 MPa后，活性巰基含量與300 MPa時沒有顯著性差異（P＞0.05），這說明300 MPa處理可能已經引起了蛋白質內部巰基充分暴露。相比于對照組，在不同壓力下，添加FG并未顯著改變MP凝膠的活性巰基含量（P＞0.05）。

圖6 不同壓力下FG對MP凝膠活性巰基含量的影響Fig. 6 Effect of fl axseed gum on reactive sulfhydryl group content of myofibrillar protein gel at different pressures

2.7 不同壓力下FG對MP凝膠微觀結構的影響

圖7 不同壓力下FG對MP凝膠微觀結構的影響Fig. 7 Effect of fl axseed gum on microstructure of myofibrillar protein gel at different pressures

三維網絡結構對MP凝膠保水性和強度有著重要的影響。從圖7中可以看出，0.1 MPa壓力下MP凝膠微觀結構存在較大孔洞，形成的交聯鏈較粗且松散。添加FG后，FG填充到蛋白凝膠孔隙中，經過加熱最終導致MP-FG凝膠表面空洞減少，形成相對致密的凝膠結構。當壓力增加到200 MPa時，MP與MP-FG凝膠形成孔徑較小、交聯較細的致密網狀結構。Zhang Ziye等[16]發現200 MPa處理減小了MP溶液的粒度，使其在加熱過程中均一排列，最終形成了致密均一的凝膠網絡結構。壓力大于200 MPa時，MP和MP-FG凝膠表面形成孔徑較大、交聯較粗糙的網絡結構。凝膠網絡結構的形成主要取決于變性和聚集的相對速率，聚集速率高于展開速率時，形成的凝膠粗糙、無序。加熱前由于高壓已經導致蛋白質充分變性展開，因此加熱時蛋白質展開速率降低，最終形成孔徑較大的網絡結構[32]。相比于對照組，MP-FG凝膠形成的網絡結構呈片狀，孔隙也相對較多。這可能是因為高壓促進蛋白與FG的相互作用，以及FG自身具有持水特性[33]，最終提高了凝膠保水性。Cando等[34]研究表明微觀結構的改變影響凝膠強度，適度的壓力促進交聯細密的網絡結構提高凝膠強度，較高的處理壓力（大于300 MPa）導致MP降解或解聚，蛋白質不規律地聚集在一起，誘導其硬度降低，這與本研究結果相似。

3 結 論

0.1 MPa（常壓狀態）和100 MPa條件下，FG通過增加MP凝膠不易流動水比例，提高了MP的凝膠保水性，但減小了其G′′和G′，導致凝膠強度顯著降低（P＜0.05）。當壓力達到200 MPa時，FG降低MP凝膠自由水比例，增加其結合水比例，進一步提高了MP凝膠的保水性；同時，FG提高了MP凝膠G′′和G′，形成較為致密均一的凝膠網絡微觀結構，顯著增強了MP凝膠強度（P＜0.05）。300～400 MPa時，隨著壓力的進一步升高，FG對MP凝膠保水性和強度的改善作用又顯著降低（P＜0.05），MP凝膠中自由水比例顯著升高，凝膠微觀孔洞也明顯增多。由此得出：200 MPa高壓處理可以進一步增強FG對MP凝膠保水性的改善作用；同時，其形成的微觀結構也相對交聯致密，改善了常壓狀態下由于添加FG導致的MP凝膠強度降低問題，因此200 MPa是較佳的處理壓力。