反膠束萃取對大豆分離蛋白結構和特性的影響

張 倩，陳復生*

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

大豆是一種富含油脂和蛋白的重要經濟作物，是世界上種植最為普遍的作物之一。大豆中約含有20%的油脂、40%的蛋白質和30%的碳水化合物，常作為一種重要的植物油料作物用于食用油的生產，副產物的主要成分是大豆蛋白。大豆蛋白氨基酸種類齊全，且人體必需氨基酸比例較高，不含膽固醇，具有較高的營養價值。此外，由于大豆蛋白來源廣、成本較低且具有較好的加工特性，因此被廣泛應用于食品行業[1-2]。目前大豆蛋白的提取方法主要是堿溶酸沉法，該方法在蛋白提取過程中會產生大量酸、堿廢水，蛋白活性也會受到影響，但因其適用范圍廣、工藝相對較為成熟，依然是主流的蛋白提取方法。

反膠束作為一種新型的高效分離技術也逐漸被大眾所熟識，近年來關于反膠束體系的研究有很多[3-6]。反膠束是表面活性劑在有機溶劑中自發形成的膠束結構，疏水性尾部朝外、親水性頭部朝內，形成類生命環境“水核”結構[7-8]。該體系能夠同時高效地分離油脂和蛋白，且能最大程度上保證蛋白質的生物活性[9]。因此，反膠束體系比較適用于油料作物油脂和蛋白的分離，在工藝流程上能有很大的簡化。

近年來，有很多關于反膠束萃取和純化蛋白質的研究，以及該方法與傳統堿溶酸沉法所提取得到的蛋白質在結構和其他理化性質方面的差異研究[10-12]。本研究系統地對比了兩種方法（反膠束法和堿溶酸沉法）分別提取的大豆分離蛋白樣品在結構和熱力學、流變學特性上的差異，分析反膠束提取對大豆分離蛋白結構和特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂大豆粉 河南省鯤華生物技術有限公司；丁二酸二異辛酯磺酸鈉（sodium bis(2-ethylhexyl)sulfo succinate，AOT） 上海海曲化工有限公司；異辛烷（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；Na2HPO4、KH2PO4、KCl、濃硫酸（分析純） 洛陽昊華化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BS210S型分析天平 德國Sartorius公司；GL-20C型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；HAAKE MARS 60動態流變儀、WQF-510A傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國Varian公司；Q20差示掃描量熱儀 美國TA Instruments公司；DYY-6D電泳槽北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 反膠束法制備大豆分離蛋白

本研究采用的是AOT/異辛烷反膠束體系。提取方法參考文獻[13]。稱取一定質量的AOT于錐形瓶中，加入一定體積的異辛烷配制成0.06 g/mL的溶液，搖勻至AOT完全溶解，然后加入含0.05 g/mL KCl的磷酸鹽緩沖液（用2 mol/L鹽酸溶液調節pH值至8.5），氣浴振蕩1 h后靜置12 h，若溶液澄清透明即為反膠束溶液，若溶液不澄清，則重新配制。取一定體積的澄清反膠束溶液，按照質量濃度0.02 g/L加入一定質量的豆粉，40 ℃水浴振蕩30 min，之后4 000 r/min離心20 min，取上清液，加入等體積的含1 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖液（pH 8.5），離心后下層溶液即為溶有大豆分離蛋白的溶液。對該溶液透析凍干后即得到反膠束法制備的大豆分離蛋白。

1.3.2 堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白

參考Zhao Xiaoyan等[14]的方法，首先在分離蛋白前需要對全脂豆粉用正己烷（質量比1∶10）進行脫脂處理。取一定量的脫脂豆粉與0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.5）按照料液比1∶20混合，40 ℃水浴振蕩1.5 h后4 500 r/min離心20 min，將上清液留作后用，沉淀重復上述操作。將兩次得到的上清液混合，用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.5后4 500 r/min離心20 min，棄去上清液，將沉淀復溶后透析凍干，即得到堿溶酸沉法制備的大豆分離蛋白。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

將蛋白粉末溶于去離子水中配制成質量濃度2 mg/mL的蛋白溶液。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）操作參照文獻[13]。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜測定蛋白的二級結構

通過KBr壓片法測定蛋白樣品的透射率的變化趨勢。每個樣品重復3 次。重點將對酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）范圍內的譜圖通過PeakFit軟件處理。

1.3.5 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定采用8-苯胺基-1-萘磺酸熒光探針法，參照文獻[15]進行操作。

1.3.6 二硫鍵含量的測定

二硫鍵含量的測定采用Ellman’s比色法[16]，總巰基含量與自由巰基含量的差值為二硫鍵含量。自由巰基含量的測定：取0.5 mL 10 mg/mL蛋白溶液加入2.5 mL Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L、pH 8.0），加入0.02 mL Ellman試劑（含4 mg/mL 5,5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸的Tris-Gly溶液），振蕩后在25 ℃保溫60 min，然后在412 nm波長處測定蛋白溶液的吸光度。總巰基含量的測定：在0.2 mL蛋白溶液中加入0.02 mL β-巰基乙醇和1 mL 10 mol/L尿素溶液（溶于Tris-Gly緩沖液），在25 ℃保溫60 min后再添加10 mL質量分數12%三氯乙酸，25 ℃保溫60 min后離心。用5 mL三氯甲烷溶液清洗沉淀物兩次，將沉淀物溶于8 mol/mL尿素中，再加入0.05 mL Ellman試劑。測定時以未添加蛋白質的溶液作為空白對照，在412 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 蛋白粒徑的測定

根據Guo Juchen等[17]的方法，采用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀對反膠束體系的粒徑和蛋白體系的多分散系數進行測定。

1.3.8 熱力學特性的測定

參照文獻[18]，采用Q20差示熱量掃描儀對蛋白質的熱變性以及玻璃態轉變溫度進行測定。熱變性的測定：在鋁盒中稱取3 mg蛋白樣品，用移液槍移取10 μL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），加蓋密封后室溫靜置過夜。測定前首先在25 ℃下穩定5 min，然后從25 ℃升溫到110 ℃，升溫速率為5 ℃/min。玻璃態轉變溫度的測定：在鋁盒中稱取一定質量的蛋白質粉末，從-10 ℃開始升溫，升溫速率為10 ℃/min，首次升溫到略高于玻璃態轉變溫度，降溫后再次加熱至180 ℃。

1.3.9 凝膠特性的測定

采用動態流變儀對蛋白溶液的凝膠特性進行測定。將蛋白樣品溶解于0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.6）中，配制成質量分數11%蛋白溶液。室溫下攪拌3 h后4 ℃靜置24～36 h，使蛋白充分水化，測定前室溫攪拌平衡30 min。采用椎板測定，間隙為0.05 mm，溫度變化過程為：以5 ℃/min從25 ℃升溫至95 ℃，在95 ℃保溫30 min，以5 ℃/min降溫至25 ℃。觀察在溫度變化的過程中儲能模量（G′）和損耗模量（G”）的變化規律。對所成凝膠進行頻率掃描（頻率為0.1～10 Hz，應力為1%），進一步對蛋白凝膠的狀態進行表征。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE結果分析

圖1 兩種方法分離提取得到的大豆分離蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis profile of different SPIs

如圖1所示，兩種方法分離的大豆蛋白的條帶對應的分子質量和標準蛋白吻合，因此可以確定兩種方法得到的蛋白樣品是大豆分離蛋白。對比兩種方法可以看出，堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白的α亞基有部分的解離現象，條帶減弱，分解成分子質量較小的條帶。這說明反膠束法相較于傳統方法而言更能保持蛋白分子的生物活性。

2.2 傅里葉變換紅外光譜定量分析蛋白的二級結構

圖2 兩種方法得到的大豆分離蛋白的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of different SPIs

如圖2所示，酰胺I帶的波數范圍為1 600～1 700 cm-1，是由肽鏈上的羰基（C＝O）結構中雙鍵的伸縮振動引起的，該振動能在一定程度上表征蛋白質的結構特征[19-20]。因此對蛋白質二級結構的表征重點分析該酰胺I帶的譜圖[21]。反膠束法和堿溶酸沉法分離得到的樣品的酰胺I帶對應的波數分別為（1 653.0±2.9）cm-1和（1 653.0±1.1）cm-1，沒有明顯差異。通過對譜圖進一步去卷積求導擬合，得到具體二級結構的含量見表1。

表1 兩種方法得到的大豆分離蛋白的二級結構含量Table 1 Contents of secondary structures in different SPIs

蛋白質二級結構的定量分析可以通過求二階求導的方法實現，酰胺I帶范圍內的二階導數擬合曲線與蛋白質二級結構的含量呈線性相關[22]。從表1可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的β-折疊含量明顯低于堿溶酸沉法，但β-轉角結構含量有所增加，這很有可能是兩種結構之間發生相互轉化。β-折疊相較于α-螺旋結構而言是一種舒展的結構，是通過眾多鏈間氫鍵相連接的穩定的片層結構，而β-轉角則是肽鏈伸展方向產生180°轉變處的分子結構[23]。因此，反膠束法得到的大豆蛋白β-折疊含量的降低和β-轉角結構含量的增加將直接導致蛋白分子穩定有序鏈層結構減少，整個分子的緊實性降低[24]，分子所占空間增加。而堿溶酸沉法得到的大豆蛋白的β-折疊含量較高，說明蛋白分子的展開程度更高。二級結構的差異一方面表明不同的提取方法會對蛋白質的結構產生影響；另一方面，結構的差異也會影響蛋白產品的相關性質，如溶解性、熱穩定性、表面疏水性、成膠性等。

2.3 蛋白質表面疏水性和二硫鍵含量的變化

表2 兩種方法得到的大豆分離蛋白的平均粒徑、多分散系數、表面疏水性和二硫鍵含量Table 2 Average particle size, polydispersity index, surface hydrophobicity and disulfide bond content in different SPIs

如表2所示，堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白對應的表面疏水性明顯高于反膠束法。表面疏水性的變化是蛋白質在提取過程中分子結構展開的程度不同導致的。堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白的分子結構展開更明顯，更多的內部疏水基團暴露出來；而反膠束方法能夠最大程度上保持蛋白質的分子鏈折疊結構，這也再次從結構上證實反膠束體系獨特的“水核結構”能夠保持蛋白質的生物活性。此外，出現這一差異的原因很可能是由于二級結構的差異，傳統方法得到的大豆分離蛋白含有較多的β-折疊結構，而β-折疊結構具有較高的疏水特性，因此，表面疏水性會隨著β-折疊含量的增加而升高[25-26]。這些結構上的差異將直接影響蛋白質的凝膠性、乳化性、溶解性等。

如表2所示，反膠束法分離得到的大豆蛋白的二硫鍵含量低于堿溶酸沉法，和Zhao Xiaoyan等[13]的研究結果是一致的。宏觀上看是由于不同方法得到的大豆分離蛋白的7S和11S亞基的含量不同，導致蛋白質分子中的二硫鍵含量也存在差異；從分子結構上看主要是由于反膠束環境會對蛋白質表面的巰基和二硫鍵產生作用，破壞二硫鍵的形成[27-28]。

2.4 蛋白質分子粒徑的變化

圖3 兩種方法得到的大豆分離蛋白的粒徑分布Fig. 3 Particle size distribution of different SPIs

從表2中平均粒徑的結果可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的平均粒徑要大于傳統堿溶酸沉法，這和Boulet等[29]的結果一致。且兩種蛋白的粒徑分布范圍都比較寬，多分散系數都在0.5左右，因此，參考平均粒徑的結果，重點通過粒徑分布圖來分析兩者粒徑之間的差異。圖3顯示了基于體積分數的粒徑分布，可以明顯看出，反膠束法得到的蛋白質樣品的粒徑分布有兩個窄峰，而堿溶酸沉法得到的蛋白溶液只有一個寬峰，位置在反膠束法樣品的兩個峰中間。表明堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白溶液中分子間聚集現象整體比反膠束方法明顯。這和表面疏水性的結果是一致的。

2.5 蛋白質的熱穩定性

圖4 兩種方法得到的大豆分離蛋白的熱變性結果Fig. 4 Differential scanning calorimetry thermograms of different SPIs

從圖4中可以看出，兩種方法得到的大豆分離蛋白都有兩個吸熱峰，這主要是由于大豆分離蛋白有7S和11S兩種亞基。反膠束法對應的變性峰值分別為（70.03±0.56）℃和（98.85±0.67）℃；傳統堿溶酸沉法對應的變性峰值分別為（75.12±0.84）℃和（97.37±0.16）℃。因此，在70～75 ℃時蛋白已經開始變性，這很有可能是部分7S亞基發生變性導致的，且反膠束法對應的變性峰溫度較低，說明反膠束法得到的7S亞基熱穩定性較差；而97～98 ℃時的變性峰則為11S亞基發生變性導致的，這和Zhao Xiaoyan等[13]的結果一致。不同方法得到的大豆分離蛋白的兩個變性峰的差異主要是因為7S和11S亞基含量存在差異[30]；此外，也有可能是蛋白質的二級結構或部分亞基發生改變導致的[31]。反膠束法得到的大豆分離蛋白吸熱峰的焓變為（6.06±0.58）J/g和（0.31±0.02）J/g；堿溶酸沉法對應的焓變為（8.47±0.60）J/g和（0.84±0.34）J/g。兩種方法焓變的差異和前述結構方面的變化一致，即堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白結構上已經部分展開，發生變性聚集時所需要的能量更高。因此，從變性溫度上可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的變性溫度較高，但從焓變可以看出，其達到變性溫度時其所需的熱量并不大，更易受到熱破壞[17]。

圖5 兩種方法得到的大豆分離蛋白的相態轉變結果Fig. 5 Glass transition temperature of different SPIs

從圖5中可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的玻璃態轉變溫度有兩個，分別是（47.76±1.62）℃和（69.38±0.62）℃；而堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白只出現了一個較為明顯的玻璃態轉變溫度（（58.81±1.42）℃）。結合圖4可以推測，反膠束法得到的大豆分離蛋白的兩個玻璃態轉變溫度分別對應的依然是7S和11S亞基；而堿溶酸沉法分離得到的大豆分離蛋白只出現了一個玻璃態轉變溫度，有可能是兩種成分玻璃態轉變出現疊加的結果。反膠束法得到的蛋白質的玻璃態轉變溫度略低于堿溶酸沉法。

2.6 蛋白質的凝膠特性

圖6 堿溶酸沉法（A）和反膠束法（B）制得大豆分離蛋白凝膠的溫度掃描圖Fig. 6 Temperature curves of SPIs of traditional alkali dissolution and acid precipitation (A) and reverse micelle (B)

對于未知樣品進行動態流變學測定前都要預先進行應力掃描確定動態黏彈區[32]。確定線性黏彈區后，最終選定溫度掃描的條件為0.5 Hz、1%形變。如圖6所示，從整體趨勢上可以看出兩種蛋白在加熱過程中G′和G”同時上升，且G′高于G”，因此可以確定凝膠體系的形成。由于兩種樣品均在相同的條件下加熱，因此G′開始激增的時間先后可以作為成膠能力的衡量標準[33]。堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白開始形成凝膠的溫度點為95.00 ℃，而反膠束法對應的大豆分離蛋白開始形成凝膠的溫度點為78.44 ℃，可以明顯看出反膠束法相較于傳統堿溶酸沉法而言更易形成凝膠。但從圖6A中可以看出，G′和G”在極短的時間內就大幅度上升；而圖6B中反膠束法得到的大豆分離蛋白的G′和G”卻整體呈現緩慢的上升趨勢，慢慢形成凝膠網絡結構，即反膠束法得到的大豆分離蛋白凝膠形成的速度較慢。此外，兩種樣品在溫度掃描結束時分別對應的G′數值可以作為凝膠剛性的表征[34]：圖6A中堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白對應的G′為1 108.96 Pa；圖6B中反膠束法得到的大豆分離蛋白對應的G′為122.70 Pa。因此，堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白形成的凝膠強度遠優于反膠束法。這可能是由于反膠束法得到的大豆分離蛋白的巰基和二硫鍵的含量較低[13,35]，致使其無法形成較為緊密的凝膠體系。

圖7 兩種方法得到的大豆分離蛋白凝膠的頻率掃描圖Fig. 7 Frequency curves of different SPIs

此外，還可以通過G′和G”以及它們的頻率依賴性（頻率掃描圖）來研究蛋白樣品所形成的凝膠的狀態，典型凝膠的G′和G”是相互平行的，且G′＞G”[36]。從圖7中可以看出，兩種樣品的G′和G”是相互平行的，且G′＞G”，即形成了典型的凝膠結構。Arzeni等[35]報道頻率掃描曲線的斜率與凝膠中聚集物的尺寸有關，斜率越大說明凝膠中分子的聚集程度越大。因此，對照圖7可以看出，堿溶酸沉法得到的蛋白凝膠的頻率掃描曲線斜率較大，即蛋白質在形成凝膠時分子交聯現象更多，這也極有可能是由該方法得到的蛋白質中二硫鍵含量的差異引起的，因為分子間的二硫鍵能促使蛋白分子亞基間形成束狀結構單元，進而形成網絡結構[37]。

3 結 論

結構上可以看出，反膠束方法得到的大豆分離蛋白的β-折疊結構含量較少，而β-轉角結構含量較多，表面疏水性較低，表明反膠束環境相較于堿溶酸沉法能最大程度地保持蛋白質的分子結構。分析蛋白質的熱力學特性可以得出結論，不同方法得到的大豆分離蛋白的熱力學變化均呈現兩個變性峰，分別對應兩種主要亞基（7S和11S球蛋白）。反膠束方法得到的大豆分離蛋白的主成分7S亞基對應的變性溫度較低，而11S亞基的變性溫度較高，但變性過程中焓變低于堿溶酸沉法，即達到變性溫度時反膠束法對應的蛋白質更易變性；且反膠束法得到的大豆分離蛋白具有較低的玻璃態轉變溫度。對兩種蛋白樣品形成凝膠的過程進行動態流變學實驗，發現反膠束法對應的蛋白質在較低溫度處G′和G”就開始發生變化，這是因為反膠束法對應的蛋白質起始變性溫度較低，且凝膠形成速度較慢，最終形成的凝膠體系強度也低于堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白。綜上所述，反膠束法相較于堿溶酸沉法而言，能較好地保持蛋白質的分子結構，但耐熱性較差，因此在較低溫度下就開始形成凝膠，但最終所成凝膠的強度較低。