反膠束萃取對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和特性的影響

張 倩，陳復(fù)生*

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

大豆是一種富含油脂和蛋白的重要經(jīng)濟作物，是世界上種植最為普遍的作物之一。大豆中約含有20%的油脂、40%的蛋白質(zhì)和30%的碳水化合物，常作為一種重要的植物油料作物用于食用油的生產(chǎn)，副產(chǎn)物的主要成分是大豆蛋白。大豆蛋白氨基酸種類齊全，且人體必需氨基酸比例較高，不含膽固醇，具有較高的營養(yǎng)價值。此外，由于大豆蛋白來源廣、成本較低且具有較好的加工特性，因此被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[1-2]。目前大豆蛋白的提取方法主要是堿溶酸沉法，該方法在蛋白提取過程中會產(chǎn)生大量酸、堿廢水，蛋白活性也會受到影響，但因其適用范圍廣、工藝相對較為成熟，依然是主流的蛋白提取方法。

反膠束作為一種新型的高效分離技術(shù)也逐漸被大眾所熟識，近年來關(guān)于反膠束體系的研究有很多[3-6]。反膠束是表面活性劑在有機溶劑中自發(fā)形成的膠束結(jié)構(gòu)，疏水性尾部朝外、親水性頭部朝內(nèi)，形成類生命環(huán)境“水核”結(jié)構(gòu)[7-8]。該體系能夠同時高效地分離油脂和蛋白，且能最大程度上保證蛋白質(zhì)的生物活性[9]。因此，反膠束體系比較適用于油料作物油脂和蛋白的分離，在工藝流程上能有很大的簡化。

近年來，有很多關(guān)于反膠束萃取和純化蛋白質(zhì)的研究，以及該方法與傳統(tǒng)堿溶酸沉法所提取得到的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和其他理化性質(zhì)方面的差異研究[10-12]。本研究系統(tǒng)地對比了兩種方法（反膠束法和堿溶酸沉法）分別提取的大豆分離蛋白樣品在結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)、流變學(xué)特性上的差異，分析反膠束提取對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂大豆粉 河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；丁二酸二異辛酯磺酸鈉（sodium bis(2-ethylhexyl)sulfo succinate，AOT） 上海海曲化工有限公司；異辛烷（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Na2HPO4、KH2PO4、KCl、濃硫酸（分析純） 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S型分析天平 德國Sartorius公司；GL-20C型高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；HAAKE MARS 60動態(tài)流變儀、WQF-510A傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國Varian公司；Q20差示掃描量熱儀 美國TA Instruments公司；DYY-6D電泳槽北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 反膠束法制備大豆分離蛋白

本研究采用的是AOT/異辛烷反膠束體系。提取方法參考文獻[13]。稱取一定質(zhì)量的AOT于錐形瓶中，加入一定體積的異辛烷配制成0.06 g/mL的溶液，搖勻至AOT完全溶解，然后加入含0.05 g/mL KCl的磷酸鹽緩沖液（用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5），氣浴振蕩1 h后靜置12 h，若溶液澄清透明即為反膠束溶液，若溶液不澄清，則重新配制。取一定體積的澄清反膠束溶液，按照質(zhì)量濃度0.02 g/L加入一定質(zhì)量的豆粉，40 ℃水浴振蕩30 min，之后4 000 r/min離心20 min，取上清液，加入等體積的含1 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖液（pH 8.5），離心后下層溶液即為溶有大豆分離蛋白的溶液。對該溶液透析凍干后即得到反膠束法制備的大豆分離蛋白。

1.3.2 堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白

參考Zhao Xiaoyan等[14]的方法，首先在分離蛋白前需要對全脂豆粉用正己烷（質(zhì)量比1∶10）進行脫脂處理。取一定量的脫脂豆粉與0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.5）按照料液比1∶20混合，40 ℃水浴振蕩1.5 h后4 500 r/min離心20 min，將上清液留作后用，沉淀重復(fù)上述操作。將兩次得到的上清液混合，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5后4 500 r/min離心20 min，棄去上清液，將沉淀復(fù)溶后透析凍干，即得到堿溶酸沉法制備的大豆分離蛋白。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

將蛋白粉末溶于去離子水中配制成質(zhì)量濃度2 mg/mL的蛋白溶液。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）操作參照文獻[13]。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜測定蛋白的二級結(jié)構(gòu)

通過KBr壓片法測定蛋白樣品的透射率的變化趨勢。每個樣品重復(fù)3 次。重點將對酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）范圍內(nèi)的譜圖通過PeakFit軟件處理。

1.3.5 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定采用8-苯胺基-1-萘磺酸熒光探針法，參照文獻[15]進行操作。

1.3.6 二硫鍵含量的測定

二硫鍵含量的測定采用Ellman’s比色法[16]，總巰基含量與自由巰基含量的差值為二硫鍵含量。自由巰基含量的測定：取0.5 mL 10 mg/mL蛋白溶液加入2.5 mL Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L、pH 8.0），加入0.02 mL Ellman試劑（含4 mg/mL 5,5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸的Tris-Gly溶液），振蕩后在25 ℃保溫60 min，然后在412 nm波長處測定蛋白溶液的吸光度。總巰基含量的測定：在0.2 mL蛋白溶液中加入0.02 mL β-巰基乙醇和1 mL 10 mol/L尿素溶液（溶于Tris-Gly緩沖液），在25 ℃保溫60 min后再添加10 mL質(zhì)量分數(shù)12%三氯乙酸，25 ℃保溫60 min后離心。用5 mL三氯甲烷溶液清洗沉淀物兩次，將沉淀物溶于8 mol/mL尿素中，再加入0.05 mL Ellman試劑。測定時以未添加蛋白質(zhì)的溶液作為空白對照，在412 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 蛋白粒徑的測定

根據(jù)Guo Juchen等[17]的方法，采用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀對反膠束體系的粒徑和蛋白體系的多分散系數(shù)進行測定。

1.3.8 熱力學(xué)特性的測定

參照文獻[18]，采用Q20差示熱量掃描儀對蛋白質(zhì)的熱變性以及玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度進行測定。熱變性的測定：在鋁盒中稱取3 mg蛋白樣品，用移液槍移取10 μL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），加蓋密封后室溫靜置過夜。測定前首先在25 ℃下穩(wěn)定5 min，然后從25 ℃升溫到110 ℃，升溫速率為5 ℃/min。玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度的測定：在鋁盒中稱取一定質(zhì)量的蛋白質(zhì)粉末，從-10 ℃開始升溫，升溫速率為10 ℃/min，首次升溫到略高于玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，降溫后再次加熱至180 ℃。

1.3.9 凝膠特性的測定

采用動態(tài)流變儀對蛋白溶液的凝膠特性進行測定。將蛋白樣品溶解于0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.6）中，配制成質(zhì)量分數(shù)11%蛋白溶液。室溫下攪拌3 h后4 ℃靜置24～36 h，使蛋白充分水化，測定前室溫攪拌平衡30 min。采用椎板測定，間隙為0.05 mm，溫度變化過程為：以5 ℃/min從25 ℃升溫至95 ℃，在95 ℃保溫30 min，以5 ℃/min降溫至25 ℃。觀察在溫度變化的過程中儲能模量（G′）和損耗模量（G”）的變化規(guī)律。對所成凝膠進行頻率掃描（頻率為0.1～10 Hz，應(yīng)力為1%），進一步對蛋白凝膠的狀態(tài)進行表征。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE結(jié)果分析

圖1 兩種方法分離提取得到的大豆分離蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis profile of different SPIs

如圖1所示，兩種方法分離的大豆蛋白的條帶對應(yīng)的分子質(zhì)量和標準蛋白吻合，因此可以確定兩種方法得到的蛋白樣品是大豆分離蛋白。對比兩種方法可以看出，堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白的α亞基有部分的解離現(xiàn)象，條帶減弱，分解成分子質(zhì)量較小的條帶。這說明反膠束法相較于傳統(tǒng)方法而言更能保持蛋白分子的生物活性。

2.2 傅里葉變換紅外光譜定量分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖2 兩種方法得到的大豆分離蛋白的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of different SPIs

如圖2所示，酰胺I帶的波數(shù)范圍為1 600～1 700 cm-1，是由肽鏈上的羰基（C＝O）結(jié)構(gòu)中雙鍵的伸縮振動引起的，該振動能在一定程度上表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征[19-20]。因此對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的表征重點分析該酰胺I帶的譜圖[21]。反膠束法和堿溶酸沉法分離得到的樣品的酰胺I帶對應(yīng)的波數(shù)分別為（1 653.0±2.9）cm-1和（1 653.0±1.1）cm-1，沒有明顯差異。通過對譜圖進一步去卷積求導(dǎo)擬合，得到具體二級結(jié)構(gòu)的含量見表1。

表1 兩種方法得到的大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量Table 1 Contents of secondary structures in different SPIs

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定量分析可以通過求二階求導(dǎo)的方法實現(xiàn)，酰胺I帶范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)擬合曲線與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量呈線性相關(guān)[22]。從表1可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的β-折疊含量明顯低于堿溶酸沉法，但β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量有所增加，這很有可能是兩種結(jié)構(gòu)之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。β-折疊相較于α-螺旋結(jié)構(gòu)而言是一種舒展的結(jié)構(gòu)，是通過眾多鏈間氫鍵相連接的穩(wěn)定的片層結(jié)構(gòu)，而β-轉(zhuǎn)角則是肽鏈伸展方向產(chǎn)生180°轉(zhuǎn)變處的分子結(jié)構(gòu)[23]。因此，反膠束法得到的大豆蛋白β-折疊含量的降低和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量的增加將直接導(dǎo)致蛋白分子穩(wěn)定有序鏈層結(jié)構(gòu)減少，整個分子的緊實性降低[24]，分子所占空間增加。而堿溶酸沉法得到的大豆蛋白的β-折疊含量較高，說明蛋白分子的展開程度更高。二級結(jié)構(gòu)的差異一方面表明不同的提取方法會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響；另一方面，結(jié)構(gòu)的差異也會影響蛋白產(chǎn)品的相關(guān)性質(zhì)，如溶解性、熱穩(wěn)定性、表面疏水性、成膠性等。

2.3 蛋白質(zhì)表面疏水性和二硫鍵含量的變化

表2 兩種方法得到的大豆分離蛋白的平均粒徑、多分散系數(shù)、表面疏水性和二硫鍵含量Table 2 Average particle size, polydispersity index, surface hydrophobicity and disulfide bond content in different SPIs

如表2所示，堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白對應(yīng)的表面疏水性明顯高于反膠束法。表面疏水性的變化是蛋白質(zhì)在提取過程中分子結(jié)構(gòu)展開的程度不同導(dǎo)致的。堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白的分子結(jié)構(gòu)展開更明顯，更多的內(nèi)部疏水基團暴露出來；而反膠束方法能夠最大程度上保持蛋白質(zhì)的分子鏈折疊結(jié)構(gòu)，這也再次從結(jié)構(gòu)上證實反膠束體系獨特的“水核結(jié)構(gòu)”能夠保持蛋白質(zhì)的生物活性。此外，出現(xiàn)這一差異的原因很可能是由于二級結(jié)構(gòu)的差異，傳統(tǒng)方法得到的大豆分離蛋白含有較多的β-折疊結(jié)構(gòu)，而β-折疊結(jié)構(gòu)具有較高的疏水特性，因此，表面疏水性會隨著β-折疊含量的增加而升高[25-26]。這些結(jié)構(gòu)上的差異將直接影響蛋白質(zhì)的凝膠性、乳化性、溶解性等。

如表2所示，反膠束法分離得到的大豆蛋白的二硫鍵含量低于堿溶酸沉法，和Zhao Xiaoyan等[13]的研究結(jié)果是一致的。宏觀上看是由于不同方法得到的大豆分離蛋白的7S和11S亞基的含量不同，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵含量也存在差異；從分子結(jié)構(gòu)上看主要是由于反膠束環(huán)境會對蛋白質(zhì)表面的巰基和二硫鍵產(chǎn)生作用，破壞二硫鍵的形成[27-28]。

2.4 蛋白質(zhì)分子粒徑的變化

圖3 兩種方法得到的大豆分離蛋白的粒徑分布Fig. 3 Particle size distribution of different SPIs

從表2中平均粒徑的結(jié)果可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的平均粒徑要大于傳統(tǒng)堿溶酸沉法，這和Boulet等[29]的結(jié)果一致。且兩種蛋白的粒徑分布范圍都比較寬，多分散系數(shù)都在0.5左右，因此，參考平均粒徑的結(jié)果，重點通過粒徑分布圖來分析兩者粒徑之間的差異。圖3顯示了基于體積分數(shù)的粒徑分布，可以明顯看出，反膠束法得到的蛋白質(zhì)樣品的粒徑分布有兩個窄峰，而堿溶酸沉法得到的蛋白溶液只有一個寬峰，位置在反膠束法樣品的兩個峰中間。表明堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白溶液中分子間聚集現(xiàn)象整體比反膠束方法明顯。這和表面疏水性的結(jié)果是一致的。

2.5 蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性

圖4 兩種方法得到的大豆分離蛋白的熱變性結(jié)果Fig. 4 Differential scanning calorimetry thermograms of different SPIs

從圖4中可以看出，兩種方法得到的大豆分離蛋白都有兩個吸熱峰，這主要是由于大豆分離蛋白有7S和11S兩種亞基。反膠束法對應(yīng)的變性峰值分別為（70.03±0.56）℃和（98.85±0.67）℃；傳統(tǒng)堿溶酸沉法對應(yīng)的變性峰值分別為（75.12±0.84）℃和（97.37±0.16）℃。因此，在70～75 ℃時蛋白已經(jīng)開始變性，這很有可能是部分7S亞基發(fā)生變性導(dǎo)致的，且反膠束法對應(yīng)的變性峰溫度較低，說明反膠束法得到的7S亞基熱穩(wěn)定性較差；而97～98 ℃時的變性峰則為11S亞基發(fā)生變性導(dǎo)致的，這和Zhao Xiaoyan等[13]的結(jié)果一致。不同方法得到的大豆分離蛋白的兩個變性峰的差異主要是因為7S和11S亞基含量存在差異[30]；此外，也有可能是蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)或部分亞基發(fā)生改變導(dǎo)致的[31]。反膠束法得到的大豆分離蛋白吸熱峰的焓變?yōu)椋?.06±0.58）J/g和（0.31±0.02）J/g；堿溶酸沉法對應(yīng)的焓變?yōu)椋?.47±0.60）J/g和（0.84±0.34）J/g。兩種方法焓變的差異和前述結(jié)構(gòu)方面的變化一致，即堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)上已經(jīng)部分展開，發(fā)生變性聚集時所需要的能量更高。因此，從變性溫度上可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的變性溫度較高，但從焓變可以看出，其達到變性溫度時其所需的熱量并不大，更易受到熱破壞[17]。

圖5 兩種方法得到的大豆分離蛋白的相態(tài)轉(zhuǎn)變結(jié)果Fig. 5 Glass transition temperature of different SPIs

從圖5中可以看出，反膠束法得到的大豆分離蛋白的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度有兩個，分別是（47.76±1.62）℃和（69.38±0.62）℃；而堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白只出現(xiàn)了一個較為明顯的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度（（58.81±1.42）℃）。結(jié)合圖4可以推測，反膠束法得到的大豆分離蛋白的兩個玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度分別對應(yīng)的依然是7S和11S亞基；而堿溶酸沉法分離得到的大豆分離蛋白只出現(xiàn)了一個玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，有可能是兩種成分玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變出現(xiàn)疊加的結(jié)果。反膠束法得到的蛋白質(zhì)的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度略低于堿溶酸沉法。

2.6 蛋白質(zhì)的凝膠特性

圖6 堿溶酸沉法（A）和反膠束法（B）制得大豆分離蛋白凝膠的溫度掃描圖Fig. 6 Temperature curves of SPIs of traditional alkali dissolution and acid precipitation (A) and reverse micelle (B)

對于未知樣品進行動態(tài)流變學(xué)測定前都要預(yù)先進行應(yīng)力掃描確定動態(tài)黏彈區(qū)[32]。確定線性黏彈區(qū)后，最終選定溫度掃描的條件為0.5 Hz、1%形變。如圖6所示，從整體趨勢上可以看出兩種蛋白在加熱過程中G′和G”同時上升，且G′高于G”，因此可以確定凝膠體系的形成。由于兩種樣品均在相同的條件下加熱，因此G′開始激增的時間先后可以作為成膠能力的衡量標準[33]。堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白開始形成凝膠的溫度點為95.00 ℃，而反膠束法對應(yīng)的大豆分離蛋白開始形成凝膠的溫度點為78.44 ℃，可以明顯看出反膠束法相較于傳統(tǒng)堿溶酸沉法而言更易形成凝膠。但從圖6A中可以看出，G′和G”在極短的時間內(nèi)就大幅度上升；而圖6B中反膠束法得到的大豆分離蛋白的G′和G”卻整體呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢，慢慢形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即反膠束法得到的大豆分離蛋白凝膠形成的速度較慢。此外，兩種樣品在溫度掃描結(jié)束時分別對應(yīng)的G′數(shù)值可以作為凝膠剛性的表征[34]：圖6A中堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白對應(yīng)的G′為1 108.96 Pa；圖6B中反膠束法得到的大豆分離蛋白對應(yīng)的G′為122.70 Pa。因此，堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白形成的凝膠強度遠優(yōu)于反膠束法。這可能是由于反膠束法得到的大豆分離蛋白的巰基和二硫鍵的含量較低[13,35]，致使其無法形成較為緊密的凝膠體系。

圖7 兩種方法得到的大豆分離蛋白凝膠的頻率掃描圖Fig. 7 Frequency curves of different SPIs

此外，還可以通過G′和G”以及它們的頻率依賴性（頻率掃描圖）來研究蛋白樣品所形成的凝膠的狀態(tài)，典型凝膠的G′和G”是相互平行的，且G′＞G”[36]。從圖7中可以看出，兩種樣品的G′和G”是相互平行的，且G′＞G”，即形成了典型的凝膠結(jié)構(gòu)。Arzeni等[35]報道頻率掃描曲線的斜率與凝膠中聚集物的尺寸有關(guān)，斜率越大說明凝膠中分子的聚集程度越大。因此，對照圖7可以看出，堿溶酸沉法得到的蛋白凝膠的頻率掃描曲線斜率較大，即蛋白質(zhì)在形成凝膠時分子交聯(lián)現(xiàn)象更多，這也極有可能是由該方法得到的蛋白質(zhì)中二硫鍵含量的差異引起的，因為分子間的二硫鍵能促使蛋白分子亞基間形成束狀結(jié)構(gòu)單元，進而形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[37]。

3 結(jié) 論

結(jié)構(gòu)上可以看出，反膠束方法得到的大豆分離蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)含量較少，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量較多，表面疏水性較低，表明反膠束環(huán)境相較于堿溶酸沉法能最大程度地保持蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。分析蛋白質(zhì)的熱力學(xué)特性可以得出結(jié)論，不同方法得到的大豆分離蛋白的熱力學(xué)變化均呈現(xiàn)兩個變性峰，分別對應(yīng)兩種主要亞基（7S和11S球蛋白）。反膠束方法得到的大豆分離蛋白的主成分7S亞基對應(yīng)的變性溫度較低，而11S亞基的變性溫度較高，但變性過程中焓變低于堿溶酸沉法，即達到變性溫度時反膠束法對應(yīng)的蛋白質(zhì)更易變性；且反膠束法得到的大豆分離蛋白具有較低的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度。對兩種蛋白樣品形成凝膠的過程進行動態(tài)流變學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)反膠束法對應(yīng)的蛋白質(zhì)在較低溫度處G′和G”就開始發(fā)生變化，這是因為反膠束法對應(yīng)的蛋白質(zhì)起始變性溫度較低，且凝膠形成速度較慢，最終形成的凝膠體系強度也低于堿溶酸沉法得到的大豆分離蛋白。綜上所述，反膠束法相較于堿溶酸沉法而言，能較好地保持蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，但耐熱性較差，因此在較低溫度下就開始形成凝膠，但最終所成凝膠的強度較低。