納豆激酶對大鼠酒精性肝損傷的改善效果及免疫調(diào)節(jié)作用

卓怡云，呂 婧，劉 穎，王子龍，劉 曼，梁 惠,*

（1.青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266021；2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071）

據(jù)統(tǒng)計，全球大約有4%的死亡與酗酒有關(guān)，已成為國際性的公共衛(wèi)生問題[1-2]。酒精性肝損傷（alcoholic liver injury，ALD）的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，包括免疫功能及脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激等因素，其中，免疫功能失調(diào)在酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色[3]。納豆是大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵成的豆制品，在發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌可分泌大量納豆激酶，這是一種堿性絲氨酸蛋白酶，以其較強的溶栓能力著稱[4]，此外，還具有降血壓[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]等功效。研究顯示，納豆能提高醉酒小鼠肝臟乙醇脫氫酶活性，拮抗酒精引起的肝臟超氧化物歧化酶活力降低和丙二醛含量升高，抑制肝組織腫瘤壞死因子-α基因表達，保護酒精性肝損傷[8]；有研究表明，納豆芽孢桿菌能顯著提高雞脾臟中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的比例，增強免疫功能[9]；納豆激酶被認(rèn)為是納豆中最活躍的功能性成分之一，以上研究均提示，納豆保護酒精性肝損傷及其改善免疫功能可能是其中的納豆激酶成分發(fā)揮了作用，但關(guān)于納豆激酶能否通過調(diào)節(jié)免疫功能改善酒精性肝損傷的研究鮮有報道。因此，本研究以納豆激酶為干預(yù)物，以酒精性肝損傷大鼠為研究對象，通過測定其肝臟功能指標(biāo)和免疫水平指標(biāo)，初步探討納豆激酶對酒精性肝損傷大鼠的改善效果及其免疫增強機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

S P F級雌性W i s t a r大鼠，8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，許可證號：SCXK（魯）2014-0007。

納豆激酶粉（530.39 FU/g） 湯臣倍健股份有限公司；甘利欣（甘草酸二胺膠囊） 江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司；白酒（酒精體積分?jǐn)?shù)56%） 北京紅星股份有限公司；抗TCRαβ-FITC抗體、抗CD161a-PE抗體 美國BD Biosciences公司；抗CD3-FITC抗體、抗 CD4-PE抗體、抗 CD8a-APC抗體 美國BioLegend公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Shandon半自動組織包埋機 美國Thermo公司；LKB-5超薄切片機 瑞典LKB公司；JEM1200EX透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；600型全自動生化分析儀日本日立公司；Accuri C6型流式細(xì)胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立及分組

飼喂普通飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采用隨機數(shù)字表法按體質(zhì)量隨機分為5 組，每組12 只。正常對照組給予生理鹽水灌胃；酒精模型組給予白酒灌胃（第1周灌胃6 mL/（kg·d mb），第2周灌胃8 mL/（kg·d mb），第3周灌胃1 0 m L/（k g·d mb），第4～1 0周灌胃11 m L/（k g·d mb）；納豆激酶對照組給予530.39 FU/（kg·d mb）納豆激酶灌胃；納豆激酶干預(yù)組給予530.39 FU/（kg·d mb）納豆激酶和酒精灌胃；甘利欣干預(yù)組給予200 mg/（kg·d mb）甘利欣和酒精灌胃。后兩組灌胃受試物1 h后給予酒精，酒精劑量同酒精模型組，其他組在同等時間給予等量生理鹽水灌胃，實驗持續(xù)10 周。

1.3.2 標(biāo)本的收集與指標(biāo)檢測

末次灌胃后禁食不禁水12 h，依次稱質(zhì)量后給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，留取部分全血用于流式細(xì)胞術(shù)測免疫細(xì)胞比例，剩余血離心分離血清用于生化指標(biāo)檢測，留取肝、脾組織，脾稱質(zhì)量，固定部分肝臟用于組織病理學(xué)觀察和超微結(jié)構(gòu)觀察，其余-80 ℃保存用于后續(xù)實驗。

1.3.3 肝組織病理學(xué)觀察

取肝組織（1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm），用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察

取各組肝組織樣品，體積均為l mm×l mm×l mm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定24 h，0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3 次；l%鋨酸固定l h，pH 7.2 PBS漂洗3 次；丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂（EPON8l2）包埋，溫箱固化，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3.5 肝功指標(biāo)測定

采用全自動生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）、膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）活力。

1.3.6 脾指數(shù)的計算

根據(jù)1.3.2節(jié)方法取樣并稱質(zhì)量后，按下式計算脾指數(shù)。

1.3.7 T淋巴細(xì)胞亞群及自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞檢測

每只大鼠腹主動脈取全血（抗凝）分3 支試管，每支試管100 μL，分別加入300 μL紅細(xì)胞裂解液，漩渦混勻，冰上放置15 min；4 ℃、450×g離心10 min分離沉淀白細(xì)胞，吸棄上清液；向白細(xì)胞沉淀中加入200 μL紅細(xì)胞裂解液，重復(fù)上述步驟1 次。向各個試管中加入100 μL pH 7.2 PBS，分別加入3種抗體組合：抗CD3-FITC 1 μL/抗 CD4-PE 2.5 μL、抗CD3-FITC 1 μL/抗CD8a-APC 1 μL、抗TCRαβ-FITC 2 μL/抗CD161a-PE 3 μL（將正常對照組分5 個單染對照，分別只加其中一種抗體，劑量同上）；輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育30 min，加2 mL PBS，400×g離心5 min，棄上清液后加1 mL PBS，采用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，方差齊的數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用最小顯著性差異法-t檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)均為α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠肝組織病理學(xué)觀察

圖1 大鼠肝組織HE染色觀察Fig. 1 HE staining of liver tissues in rats

由圖1可知，正常對照組和納豆激酶對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞排列整齊，胞漿完整充盈；酒精模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索排列紊亂，可見大小不等、形狀不一的胞漿空泡和脂肪變性，中央靜脈和匯管區(qū)可見大量炎性細(xì)胞浸潤；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，肝索排列較為整齊，有少量空泡和脂滴，散在可見炎性細(xì)胞浸潤；甘利欣干預(yù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，偶見空泡和脂滴，肝竇無擴張，肝細(xì)胞無明顯變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變，匯管區(qū)有少量炎細(xì)胞浸潤。

2.2 大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)

由圖2可知，正常對照組和納豆激酶對照組大鼠肝細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核膜完整清晰，線粒體形態(tài)正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，核糖體豐富；酒精模型組細(xì)胞核出萎縮、變形等改變，線粒體數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張斷裂，排列紊亂無序，核糖體脫落稀疏，溶酶體數(shù)量增加；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組細(xì)胞核明顯恢復(fù)，線粒體病變明顯減輕且數(shù)目增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂與排列紊亂程度改善，溶酶體數(shù)量減少；甘利欣干預(yù)組大鼠核膜較規(guī)則，線粒體結(jié)構(gòu)正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列較整齊，核糖體數(shù)量相對增多，偶見溶酶體。

圖2 大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)Fig. 2 Ultrastructure of rat liver tissues

2.3 納豆激酶對酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、GGT、CHE活力的影響

表1 納豆激酶對大鼠血清ALT、AST、GGT、CHE活力的影響（n＝12）Table 1 Changes in serum levels of ALT, AST, GGT and CHE in rats from different groups (n= 12)

由表1可知，與正常對照組相比，酒精模型組大鼠血清ALT、AST、GGT活力顯著上升（P＜0.05），CHE活力顯著下降（P＜0.05）；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組和甘利欣干預(yù)組大鼠血清ALT、AST、GGT活力均顯著下降（P＜0.05），CHE活力有一定程度上升，其中，納豆激酶干預(yù)組大鼠血清ALT、AST、GGT活力下降程度和CHE活力上升程度均低于甘利欣干預(yù)組。納豆激酶對照組與正常對照組相比各指標(biāo)無明顯變化。

2.4 納豆激酶對酒精性肝損傷大鼠脾指數(shù)的影響

由表2可知，與正常對照組相比，酒精模型組大鼠體質(zhì)量、脾質(zhì)量和脾指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組和甘利欣干預(yù)組大鼠體質(zhì)量、脾質(zhì)量和脾指數(shù)均有不同程度增高，其中脾指數(shù)顯著增高（P＜0.05），納豆激酶干預(yù)組各指標(biāo)增高程度均高于甘利欣干預(yù)組，納豆激酶對照組與正常對照組相比各指標(biāo)無明顯變化。

表2 納豆激酶對大鼠脾指數(shù)的影響（n＝12）Table 2 Changes in spleen index in rats from different groups (n= 12)

2.5 納豆激酶對酒精性肝損傷大鼠T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞比例（占淋巴細(xì)胞比例）的影響

圖3 納豆激酶對大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的影響Fig. 3 Effect of nattokinase on T lymphocyte subsets and NK cells in peripheral blood of rats

由圖3、表3可知，與正常對照組相比，酒精模型組大鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例、TCRαβ+CD161+NK細(xì)胞比例均顯著下降（P＜0.05）；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組和甘利欣干預(yù)組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），TCRαβ+CD161+NK細(xì)胞比例有不同程度的上升趨勢。納豆激酶干預(yù)組各指標(biāo)升高程度均高于甘利欣干預(yù)組，納豆激酶對照組與正常對照組相比各指標(biāo)無明顯變化。

表3 大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞比例（n＝3）Table 3 Proportion of T lymphocyte subsets and NK cells in peripheral blood of rats (n= 3)

3 討 論

酒精在體內(nèi)代謝主要依賴于肝臟，長期過度飲酒易導(dǎo)致肝損傷。多項研究表明，酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中存在免疫功能障礙，長期飲酒會抑制機體的天然免疫細(xì)胞，降低淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的數(shù)量和活性，NK細(xì)胞脫顆粒的能力受損，明顯抑制其免疫功能，引起肝細(xì)胞的直接損傷，增強了長期嗜酒者發(fā)展為肝炎、肝硬化或肝癌的敏感性[10-12]。納豆是日本傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，類似于中國的豆豉[13]。納豆激酶最早于1987年由日本學(xué)者等從納豆中發(fā)現(xiàn)[14]，又稱纖溶酶，其改善心血管疾病的功能已進行大量研究[15]。郭力榕[8]研究發(fā)現(xiàn)，納豆具有解酒和改善酒精性肝損傷的作用。Xu Xin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌能促進淋巴細(xì)胞增殖，激活巨噬細(xì)胞，進而增強免疫功能。Inooka等[17]研究表明，枯草芽孢桿菌能增強雞抗綿羊紅細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，提高其免疫功能。根據(jù)以上研究，推測其作用機制與枯草芽孢桿菌分泌的代謝產(chǎn)物納豆激酶有關(guān)，但相關(guān)研究少見，因此，本研究選擇納豆激酶作為干預(yù)物，探討納豆激酶能否通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性改善酒精誘導(dǎo)的肝損傷。

本研究通過酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝損傷模型，通過肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，酒精暴露引起大鼠肝臟明顯的組織結(jié)構(gòu)損傷，納豆激酶干預(yù)對酒精引起的肝臟損傷有顯著改善作用。ALT、AST和GGT是肝細(xì)胞內(nèi)重要的酶，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，致使血清酶活性增加[18]。CHE活力是肝合成蛋白質(zhì)功能指標(biāo)，血液中含量降低表明肝臟功能異常[19]。本實驗血清生化指標(biāo)結(jié)果表明，酒精暴露引起大鼠肝臟功能損傷，納豆激酶安全、無毒性，能減輕酒精引起的肝臟功能異常，其改善肝臟功能效果低于甘利欣（保肝藥）。

脾臟是機體最重要的外周免疫器官之一，是免疫細(xì)胞增殖和接受抗原刺激產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答的場所，擁有全身循環(huán)T淋巴細(xì)胞的25%，直接參與細(xì)胞免疫，并對外周血中T淋巴細(xì)胞亞群分布有重要調(diào)節(jié)作用，脾指數(shù)間接反應(yīng)機體的免疫水平[20]。本實驗脾指數(shù)結(jié)果顯示，酒精攝入引起大鼠免疫功能降低，納豆激酶無免疫毒性，且能抑制酒精引起的免疫功能降低，其保護效果優(yōu)于甘利欣。

近年來的研究表明，T淋巴細(xì)胞的免疫狀態(tài)與酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[21]。T淋巴細(xì)胞亞群水平可評估機體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，CD4+T淋巴細(xì)胞協(xié)助其他細(xì)胞參與免疫應(yīng)答；CD8+T淋巴細(xì)胞對免疫應(yīng)答有負(fù)性調(diào)節(jié)功能[22]，兩者相互協(xié)調(diào)，相互制約，共同維系機體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，任何一種細(xì)胞的數(shù)量和功能發(fā)生異常變化時，都可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[23]。研究發(fā)現(xiàn)，酒精肝炎患者中通常有淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，酒精戒斷和恢復(fù)過程中，淋巴細(xì)胞數(shù)量沒有顯著改變[24]。Naude等研究結(jié)果顯示，青少年酒精性肝損傷患者中，CD4+和 CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，導(dǎo)致免疫功能下降，增加傳染病的易感性[25]。Laso等研究顯示，慢性乙醇攝入影響酒精性肝硬化患者的免疫系統(tǒng)，使 CD4+、CD8+等T淋巴細(xì)胞亞群水平降低，T淋巴細(xì)胞總量明顯下降[26]。NK細(xì)胞是機體中主要的天然免疫細(xì)胞之一，具有殺傷活性。NK細(xì)胞通過特異性受體與靶細(xì)胞表面特異性配體相結(jié)合，殺傷腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞[27]。具有抗病毒和抗腫瘤、抗纖維化的作用，通過巨噬細(xì)胞的極化調(diào)節(jié)肝臟炎癥和細(xì)胞修復(fù)之間的平衡，在調(diào)節(jié)組織纖維化和癌癥等慢性炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[28]。有研究顯示，NK細(xì)胞能抑制肝星狀細(xì)胞激活，誘導(dǎo)其凋亡[29]，對宿主具有保護作用，而酒精攝入會破壞這種保護作用[30]；Cui Kele等研究表明，在一個慢性加單狂歡飲酒小鼠模型中，NK細(xì)胞通過γ干擾素保護乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性[31]。本研究結(jié)果顯示，酒精暴露引起大鼠免疫功能失調(diào)，與相關(guān)文獻報道結(jié)果[32]一致；納豆激酶干預(yù)能明顯改善酒精引起的免疫功能失調(diào)，其機制可能是通過調(diào)節(jié)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞比例有關(guān)，其免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于甘利欣。

綜上所述，長期一定量酒精攝入會引起大鼠肝臟損傷和免疫功能失調(diào)，而補充納豆激酶在一定程度上可以保護酒精性肝損傷，其機制可能是通過調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞比例，提高機體的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。