對蝦原肌球蛋白致敏小鼠模型的構建及乳酸菌腸黏膜免疫效應對致敏性的影響

傅玲琳，富舒潔，黃健健，錢 怡，王 翀，王彥波*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江食品質量安全工程研究院，浙江 杭州 310018）

食物過敏通常是由食品中無害蛋白抗原引起的免疫系統紊亂，具有潛在致命性[1]。食物過敏對胃腸道的影響主要表現為口腔刺痛、瘙癢、惡心、腹痛、嘔吐；對呼吸道的影響主要表現為氣喘和呼吸道炎癥；對皮膚的影響主要表現為皮膚紅腫、蕁麻疹、血管性水腫、瘙癢；也有可能發生全身性過敏反應[1]。近年來，對水產品尤其是蝦、蟹等甲殼類水產品過敏的人群比例逐年上升[1]。已有研究表明，南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）中的主要過敏原為原肌球蛋白（tropomyosin，TM），其能夠引起免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介導的速發型超敏反應[2]。TM是一種熱穩定的蛋白，日常生活中即使經過高溫烹飪也難以消除其過敏原性，有大量的學者致力于對其過敏原性削減的研究。研究表明，食物熱處理加工過程中的烘烤、油炸、微波、煮沸等方式均不能降低TM的過敏原性[3-10]，因此，探究TM致敏機制從而發展相應的過敏防治手段有一定的理論意義和應用價值。

益生菌因其對機體的保健作用而受到廣泛的關注，有大量研究表明其能夠緩解食物過敏，例如鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG）、干酪乳酸菌代田株（Lactobacillus casei Shirota）和乳酸雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis BE）等都被證明具有調節腸道菌群結構、抑制炎癥等免疫調節作用[11-13]。此外，乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌株被發現能夠促進IgA的分泌并抑制IgE的分泌，從而增強口服免疫耐受，緩解食物過敏[14-16]。Schiavi等[11]從刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）中提純出TM并用以建立致敏模型，通過口服灌胃益生菌混合物（VSL#3），發現其可以緩解小鼠TM過敏。

雙歧桿菌是健康嬰兒糞便中的優勢菌，并且口服后能夠定植于腸道中，在黏膜免疫反應中起到重要的作用，進而對食物過敏起到調控作用[17]。肥大細胞（mast cells，MCs）來源于造血干細胞分化，通常分布于黏膜組織，靠近上皮細胞、腺體、平滑肌細胞和神經。MCs作為效應細胞參與IgE介導的食物過敏、哮喘等病理過程。MCs表面的IgE受體一旦與IgE結合或通過其他機制被激活后，能夠釋放多種不同的介質，從而進一步引起一系列的食物過敏反應[18]。杯狀細胞位于腸上皮，其分泌的黏液覆蓋于腸上皮細胞，作為第一道物理屏障，阻擋病原菌、過敏原等的入侵；它還能分泌抗菌分子，如溶酶菌和乳鐵蛋白。嗜酸性粒細胞（eosinophil，Eo）能夠表達FcεR、FcαR、FcγR受體，并與抗原特異性IgE結合，在抗原刺激下引起Eo脫顆粒，從而向腸道黏膜組織中釋放炎性顆粒（細胞因子，如血小板活化因子、白三烯等）。

動物模型使對與食物過敏相關的致敏機理、脫敏治療等的研究成為可能，因此，越來越多的學者建立相應的動物模型開展各項食物過敏相關研究，并取得了豐富的研究成果。Capobianco等[19]從刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）中提純出TM，口服灌胃8 周齡雌性C3H/HeJ小鼠構建TM致敏模型，發現通過口服灌胃TM可以構建TM小鼠模型，為TM致敏研究提供了有力的工具和思路。但是目前鮮有雌、雄小鼠在TM致敏模型構建中的比較研究，也鮮有文獻報道腸黏膜免疫在TM致敏及益生菌治療模型中的作用[20]，相關問題亟待進一步的研究闡明。

綜上所述，本研究以南美白對蝦為原料，以TM為過敏原腹腔注射6 周齡雌、雄BALB/c小鼠，構建TM致敏模型；進一步口服灌胃雙歧桿菌、凝結芽孢桿菌治療TM致敏小鼠，構建TM治療模型；最終從腸黏膜免疫角度探究TM致敏及益生菌治療機理，為食物過敏機理、益生菌治療機理、黏膜免疫反應等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡SPF級雌、雄性BALB/c小鼠（許可證號：SYXK（浙）2016-0014） 浙江省中醫藥大學動物實驗研究中心。

南美白對蝦（Litopenaeus vannamei） 浙江杭州蕭山養殖場；長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202（菌種編號：ATCC15697） 中國普通微生物菌種保藏管理中心；芽孢乳酸菌09.712分離純化于大黃魚腸道，由浙江工商大學食品與生物工程學院實驗室保存。

胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptic soy broth，TSB）、乳酸菌選擇性培養基（de Man, Rogosa and Sharp，MRS） 青島高科園海博生物有限公司；兔抗小鼠IgE單克隆抗體、兔抗小鼠IgG2a單克隆抗體、兔抗鼠CD4單克隆抗體 美國Abcam公司；兔抗小鼠蛋白多糖（proteoglycan，PRG）抗體 美國GeneTax公司；小鼠組胺（histamine，HIS）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 杭州百細生物有限公司；3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB） 美國eBioscience公司；氯乙酸萘酚酯酶染色試劑盒、過碘酸希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司；其余試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

臺式冷凍高速離心機 美國Beckman Coulter公司；Milli-Q超純水裝置 美國Millipore公司；VersaMax型酶標儀 美國Molecular Devices公司；STP120脫水機、AP280-2包埋機、HM335E切片機、Eclipse 80i顯微鏡日本Nikon公司；凝膠成像系統 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 益生菌培養及菌懸液制備

雙歧桿菌：稱取52.24 g MRS固體粉末溶于1 000 mL蒸餾水中，高溫滅菌后備用。取1 mL活化后的雙歧桿菌接于100 mL MRS肉湯中，37 ℃培養24 h，3 000 r/min離心10 min取沉淀，用適量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸，調整細胞數為2×1010CFU/mL。

凝結芽孢桿菌懸液：稱取30 g TSB固體粉末溶于1 000 mL蒸餾水中，高溫滅菌后備用。取1 mL活化后的凝結芽孢桿菌接于100 mL TSB肉湯中，37 ℃培養12 h，3 000 r/min離心10 min取沉淀，用適量PBS重懸，調整細胞數為2×1010CFU/mL。

1.3.2 小鼠免疫方案

將60 只6 周齡BALB/c小鼠（雌、雄各半）按照性別分別隨機分為5 組，每組6 只，分別記為空白（Ctrl）組、佐劑（Ad）組、TM致敏（TM）組、雙歧桿菌治療（Bi）組、凝結芽孢桿菌治療（Bc）組。小鼠飼喂條件：溫度為（23±3）℃，相對濕度為（50±10）%，自由飲水，按照標準實驗動物飼養方法飼養。

圖1 小鼠免疫方案Fig. 1 Mice immunization protocol

小鼠免疫方案如圖1所示：小鼠預飼養1 周，第7天開始致敏，將TM溶于PBS（600 μg/100 μL），與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔注射致敏小鼠，每只小鼠注射200 μL；第14、21天將TM溶液與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，腹腔注射致敏小鼠，每只小鼠注射200 μL；第28、35天激發小鼠，灌胃對應致敏劑量2 倍的TM進行激發；空白組每次注射等體積的無菌PBS；佐劑組每次注射等體積無菌PBS乳化過的相應佐劑；Bi和Bc組分別從第14天開始口服灌胃2×1010CFU/mL長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202菌液、芽孢乳酸菌09.712菌液（300 μL/只），連續灌胃20 d，最后一次激發后禁食。最后一次激發30～60 min觀察小鼠的過敏癥狀，第2天斷頸處死。在小鼠第1次致敏前（第7天）、第3次致敏后（第21天）、最后一次激發后（第35天）眼眶靜脈取血，血樣室溫凝固1 h后3 000 r/min離心10 min取上清液得到血清，分裝凍存于-20 ℃，避免反復凍融；小鼠致死后分別取小腸、大腸。

1.3.3 過敏癥狀評分

最后一次激發30～60 min后觀察小鼠的過敏及腹瀉癥狀，參照文獻[13]評分系統稍作修改，具體評分系統如表1所示。

表1 小鼠腹瀉及過敏癥狀評分表Table 1 Diarrhea and clinical anaphylaxis symptom scoring system of mice

1.3.4 血清中HIS質量濃度及TM特異性抗體（IgE）水平的檢測

小鼠血清中HIS質量濃度的測定參照試劑盒說明書進行。用包被緩沖液（0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3、pH 9.6）稀釋TM至10 μg/mL，向96 孔板中每孔加入100 μL，4 ℃包被過夜；用含質量分數0.05%吐溫20的PBS（PBST）洗板3 次，拍干；每孔加入200 μL封閉液（含質量分數5%牛血清白蛋白的PBS），室溫孵育1 h；用PBST洗板3 次，拍干。每孔加入稀釋后的血清（檢測IgE時稀釋體積比為1∶5、檢測IgG2a時稀釋體積比為1∶100）100 μL，4 ℃孵育過夜；用PBST洗板3 次，拍干；每孔加入稀釋后的酶標二抗（分別為辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HPR）-IgE、HPR-IgG2a，均以體積比1∶1 000稀釋）100 μL，室溫孵育1 h；用PBST）洗板5 次，拍干；每孔加入100 μL TMB溶液，室溫孵育15 min；每孔加入50 μL終止液，在波長490 nm處測定OD值以表征IgE水平。

1.3.5 杯狀細胞PAS染色

將不同部位的腸道切片置于60 ℃烤箱中烘烤2 h，使石蠟切片脫蠟。用去離子水使切片水化。室溫下將玻片浸沒于高碘酸溶液中5 min，用超純水將玻片沖洗干凈；再于室溫下將玻片浸沒于Schiff試劑中復染15 min，用流水沖洗玻片5 min；用蘇木紫染液復染玻片，用流水沖洗玻片，干燥后封片，用顯微鏡觀察。

1.3.6 MCs氯乙酸萘酚酯酶染色

用檸檬酸-丙酮-甲醇固定劑室溫固定切片1 min，用超純水沖洗干凈，在室溫下干燥至少20 min。預熱50 mL Trizmal 6.3稀釋緩沖液至37 ℃，加入1 粒Fast Corinth V Salt，充分溶解后加入2 mL 萘酚AS-D-氯乙酸酯，溶液變混濁，繼續攪拌15～30 s，將配制好的染色液倒入玻片染色缸中。將樣品玻片置于上述染色液中，37 ℃避光孵育5 min；取出玻片，超純水沖洗3 min；用蘇木精復染，孵育10 min，用流水沖洗干凈；室溫下干燥后蓋片，用顯微鏡觀察。

1.3.7 免疫組化檢測小鼠腸道中的CD4+T細胞和Eo

將不同部位的腸道切片置于60 ℃烤箱烘烤2 h，使石蠟切片脫蠟；用自動染色機程序2（分別用二甲苯、無水乙醇、體積分數95%乙醇浸染15、5、5 min，各2 次）脫蠟至水相；用超純水水洗2 min。高壓鍋內放適量自來水，將0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）倒入燒杯內（體積視切片數量而定），將燒杯置于高壓鍋內煮沸（高壓鍋不需蓋緊），將切片放入裝有修復液的燒杯內，蓋緊高壓鍋，加熱至設定壓力冒氣后持續2 min，用自來水冷卻。用體積分數3% H2O2溶液處理10 min，以消除內源性過氧化物酶活性，降低背景值。用PBS洗5 min，共3 次；滴加一抗（兔抗小鼠CD4或兔抗小鼠PRG抗體），4 ℃孵育過夜，第2天于37 ℃孵育60 min。用PBS洗5 min，共3 次；滴加二抗（HPR標記聚合物），37 ℃孵育20 min；用PBS洗5 min，共3 次；二氨基聯苯胺顯色5 min。用自動染色機程序2復染、透明后封片，用顯微鏡觀察。

1.3.8 小鼠腸道組織癥狀評分

小鼠腸道各部位組織癥狀評分標準如表2所示。

表2 小鼠腸道組織過敏癥狀評分標準Table 2 Mice intestinal histological scoring system

1.4 數據處理與分析

實驗得到的所有數據使用SPSS 14.0、Graph Prism 6.0軟件進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示存在顯著性差異。實驗數據使用Graph Prism 6.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 過敏癥狀評分

如圖2所示，雌性小鼠在最后一次致敏后過敏癥狀較為嚴重，出現腹瀉，反復抓撓耳朵、嘴巴，后腳反復撓耳道，活動量減少，耳朵、眼睛紅腫，呼吸速率增加，毛發豎立，眼球突出，結膜充血，刺激后無反應，顫抖，驚厥等過敏癥狀，甚至出現了小鼠死亡。Bi和Bc組小鼠的過敏癥狀減弱，與TM組相比存在極顯著差異。

圖2 雌、雄TM致敏BALB/c小鼠過敏癥狀評分Fig. 2 Anaphylaxis scores in female and male TM-induced BALB/c mice

雄性TM組BALB/c小鼠也同樣出現了輕微的過敏癥狀，相較于佐劑組雖然存在極顯著差異，但是過敏癥狀仍然弱于雌性小鼠。從過敏癥狀評分來看，長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712并沒有起到緩解過敏的益生作用。

2.2 血清中HIS質量濃度及TM特異性抗體（IgE）水平分析

圖3 雌、雄TM致敏BALB/c小鼠血清中HIS質量濃度Fig. 3 Histamine levels in serum samples from female and male BALB/c mice model

從圖3A中可知，最后一次致敏后，TM組小鼠血清中的HIS質量濃度高度顯著高于佐劑組，Bi和Bc組中HIS質量濃度高度顯著低于TM組。HIS是IgE介導的食物過敏的重要炎性介質之一，TM組HIS質量濃度相較于對照組高度顯著升高，說明小鼠開始出現過敏反應，并且長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712能夠下調TM致敏小鼠血清中HIS質量濃度。

從圖3B可知，相較于雌性小鼠，雖然雄性小鼠血清中總體HIS質量濃度較高，但是TM組小鼠并沒有出現HIS質量濃度增加的情況，說明并沒有出現HIS炎性介質的釋放，益生菌也沒有起到調節HIS質量濃度的益生作用。因此，單從小鼠血清中HIS質量濃度變化的角度來說，雌性小鼠更容易構建TM致敏及益生菌治療模型。

圖4 不同組別雌性BALB/c小鼠血清中TM特異性IgE水平Fig. 4 TM-specific IgE levels in serum samples from female BALB/c mice model

如圖4所示，最后一次致敏后TM組小鼠血清中的抗原特異性IgE水平明顯增加，說明TM引起了較為嚴重的食物過敏反應。Bi組小鼠血清中TM特異性IgE水平顯著下降，Bc組小鼠血清中IgE水平也有下調。而雄性小鼠血清中未檢測到TM特異性IgE。由此可知，雌性小鼠更容易構建TM誘導的IgE介導的食物過敏模型，并且長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712均能夠下調TM致敏小鼠血清中IgE水平，緩解食物過敏。

2.3 小鼠腸道中杯狀細胞分析

圖5 雌、雄小鼠PAS染色腸道組織切片圖Fig. 5 Periodic acid-Schiff staining of gut segments in female and male mice

圖6 雌、雄小鼠PAS染色腸道組織切片的組織癥狀評分Fig. 6 Histological scores of periodic acid-Schiff staining in female and male mice

從圖5、6可以看出，雌、雄性小鼠空白組中，腸絨毛完整排列整齊，杯狀細胞均勻分布于腸絨毛上。與空白組相比，佐劑組黏膜厚度略有增加，而其他方面并無太大差別。TM組雌、雄小鼠差異很大，雌性小鼠腸絨毛出現大量斷裂、壞死，排列紊亂，甚至脫落到腸腔，腸腔內可見大量的絨毛碎片，腸黏膜逐漸增厚，甚至出現潰瘍和壞死，且杯狀細胞數目明顯減少，這與絨毛大量斷裂脫落、腸黏膜肌層的病變有關；而雄性小鼠過敏癥狀較弱。觀察雌性小鼠Bi組和Bc組可以看出，相比于TM組，其腸絨毛未出現大量脫落的現象，腸絨毛排列、黏膜肌層厚度均與空白組相似，說明長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712有效緩解了小鼠的過敏癥狀，保護了其腸道的完整性，且使其杯狀細胞的數目增加、分布均勻。Bi組小鼠的小腸絨毛長度、隱窩深度、黏膜厚度和黏膜肌層厚度與空白組無異，說明長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202具有更好的治療效果；而雄性小鼠中差異不明顯。

2.4 小鼠腸道中的MCs分析

圖7 雌、雄小鼠氯乙酸萘酚酯酶染色腸道組織切片圖Fig. 7 Chloroacetate esterase staining of gut segments in female and male mice

圖8 雌、雄小鼠氯乙酸萘酚酯酶染色腸道組織切片的組織癥狀評分Fig. 8 Histological scores of chloroacetate esterase staining of gut segments in female and male mice

與杯狀細胞相似，通過比較圖7、8中雌、雄小鼠的過敏程度以及MCs的數目可以發現，雌性小鼠致敏效果更好，致敏程度更嚴重，MCs脫顆粒，腸黏膜增厚嚴重，基本無完整的腸絨毛存在，并且伴隨著潰瘍的出現。長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712的治療效果明顯，小腸組織的潰瘍和炎癥情況明顯減輕。雄性小鼠的致敏和治療的效果不明顯。

2.5 小鼠腸道CD4+ T細胞分析

圖9 雌、雄小鼠腸道各部位CD4＋ T細胞免疫組化圖Fig. 9 Immunohistochemistrical analysis of gut segments for CD4＋ T cells in female and male mice

圖10 雌、雄小鼠腸道CD4+ T細胞免疫組化組織癥狀評分Fig. 10 Histological scores of immunohistochemistrical analysis for CD4＋ T cells in female and male mice

從圖9、10中可以看出，TM組小鼠相較于空白組和佐劑組過敏程度更嚴重，不僅腸絨毛大量斷裂、壞死并脫落到腸腔，而且出現腸黏膜增厚甚至潰瘍和壞死，CD4+T細胞數目明顯增加。相比于TM組，Bi、Bc組小鼠腸絨毛未出現大量脫落的現象，腸絨毛排列、黏膜肌形態健康，說明長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712具有明顯的治療作用，且能使CD4+T細胞的數目增加、分布均勻。而雄性小鼠過敏癥狀不明顯。

2.6 小鼠腸道Eo分析

圖11 雌、雄小鼠腸道各部位Eo免疫組化圖Fig. 11 Immunohistochemistry of gut segments for eosinophils in female and male mice

圖12 雌、雄小鼠腸道免疫組化組織癥狀評分Fig. 12 Histological scores of immunohistochemistrical analysis for eosinophils in female and male mice

從圖11、12中可以看出，TM致敏后Eo的分泌明顯增加，充滿于腸絨毛和腸黏膜內。比較雌、雄小鼠可以發現，雌性小鼠的過敏反應更強烈，黏膜增厚數倍；通過益生菌治療，其腸道組織過敏反應明顯好轉，且Eo清晰、均勻。雄性小鼠變化不明顯，難以看出清晰的變化規律。

3 討 論

小鼠模型具有周期短、免疫系統與人類相似等優點，這使其在免疫學基礎研究中被廣泛應用[21]。小鼠的過敏反應與人類十分相似，包括過敏癥狀、體液免疫和細胞免疫等方面，因此常被用于構建食物過敏模型[11-12,22-27]。但是小鼠致敏模型的構建受多方面因素的影響，比如性別、基因背景、小鼠品系、致敏方式、過敏原來源、佐劑的使用等，闡明這些因素的影響程度及其機制對于建立穩定可靠的模型，開展進一步的研究至關重要。

性別被認為是影響過敏的因素之一，通常認為雌性小鼠更易發生過敏，表現為產生更多的抗原特異性IgE，同時CD4+T細胞表達上調，細胞因子白介素-4含量增加，淋巴細胞和Eo浸潤，調節性T細胞數量減少[21,28]。除此之外，激素也是影響免疫系統的因素之一，如睪丸激素和雌激素[29]。盡管大量食物過敏的模型均使用雌性動物，但是近年來雄性小鼠在過敏中的應用也為食物過敏研究提供了新的角度。雄性小鼠致敏前服用雷帕霉素可以降低IgE水平，使局部（腸道）和全身（血清）MCs反應減弱以及過敏癥狀減輕[30]。盡管已經有研究用雌性BALB/c小鼠構建了TM致敏模型，但是對雄性小鼠TM模型的建立鮮有報道[11,19,23-24,26,31]。因此，本研究同時選用了雌性和雄性小鼠構建致敏模型，并比較了兩者的差異，旨在為TM致敏模型的構建提供一些理論參考。

實驗結果表明，雌性小鼠在致敏后血清中TM特異性IgE水平和HIS質量濃度明顯高于雄性小鼠。Pilegaard等[32]的研究同樣表明雌性小鼠相較于雄性小鼠更容易發生食物過敏，從而產生更多的IgE。這可能與小鼠體內的性激素有關，雌激素可以增強抗體分泌和體液免疫，從而使小鼠更容易過敏[29]。通過將TM組小鼠與治療組小鼠相比，其炎癥相關性指標如IgE水平、HIS質量濃度都有所下調，表明無論是長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202還是芽孢乳酸菌09.712都能在一定程度上緩解TM過敏。

食物過敏原被腸道消化，由腸道上皮細胞轉運并被腸道相關的淋巴組織捕獲，從而產生免疫應答，如T細胞分化、炎性細胞因子產生、MCs和嗜酸性細胞浸潤，進一步誘發免疫腸道組織損傷和黏膜紊亂[33-34]。

通過PAS染色法、氯乙酸萘酚酯酶染色法和免疫組化法病理切片，可以發現TM組小鼠腸道發生組織病變，主要表現在腸絨毛排列紊亂、腸絨毛脫落至腸腔、局部出現潰瘍、黏膜基層變厚等黏膜組織病變。過敏相關細胞如杯狀細胞、MCs、CD4+T細胞數量增加，Eo浸潤，部分細胞開始凋亡。長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712能夠緩解腸道組織病變。

腸道菌群在食物過敏中起著重要的作用。Hill等通過研究無菌小鼠、抗生素處理小鼠及野生型小鼠，發現野生型小鼠的食物過敏耐受性更強[35]。雙歧桿菌、芽孢桿菌能夠通過重建腸道菌群結構調節腸道代謝產物，進而影響腸黏膜免疫反應，緩解食物過敏[36-38]。因此，長雙歧桿菌嬰兒亞種1.2202和芽孢乳酸菌09.712的益生作用可能與其能夠改變腸道菌群的結構有關，其具體的機制有待于進一步研究。