青蛤酶解多肽對RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

葉盛旺，楊最素，李 維，唐云平，黃芳芳，張小軍，余方苗,,*，丁國芳,

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021）

生物活性肽是一類含有2～20 個(gè)氨基酸的特異性蛋白片段，具有多種潛在的生物學(xué)活性[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽在抗腫瘤、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等方面表現(xiàn)出了重要的生理功能。如賈盈露等[2]通過蛋白酶水解的方法從雙齒圍沙蠶中制備了雙齒圍沙蠶多肽（Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe），活性研究表明，其對肺癌A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。趙卉雙[3]用堿性蛋白酶水解大黃魚魚卵水溶性蛋白，經(jīng)過分離純化得到4 種抗氧化肽（NPCASR、QESEEY、NEVGA、AMCC），通過觀察其對H2O2誘導(dǎo)的HepG-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用發(fā)現(xiàn)，4 種抗氧化肽的添加可有效的提高細(xì)胞存活率，且能明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白的表達(dá)。鄧志程等[4]以馬氏珠母貝為原料，模擬胃腸道消化的方式對其進(jìn)行酶解，經(jīng)多級(jí)分離純化后得到兩種寡肽（Ala-Arg/Pro-Met、Val-Arg），通過體外研究發(fā)現(xiàn)兩種寡肽對于脾淋巴細(xì)胞的增殖和巨噬細(xì)胞吞噬功能的提高都具有明顯的促進(jìn)作用，表現(xiàn)出了免疫調(diào)節(jié)作用的潛在價(jià)值。故本研究以RAW264.7巨噬細(xì)胞相對增殖率為指標(biāo)，從青蛤中制備具有免疫調(diào)節(jié)作用的生物活性肽。

青蛤是屬簾蛤科的一種雙殼軟體動(dòng)物，是我國貝類水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的雙殼貝類之一[5]。近年來的研究表明，青蛤多糖在抗氧化、抗腫瘤及保肝護(hù)肝等方面都具有良好的生物活性[6-8]，但關(guān)于青蛤多肽（Cyclina Sinensis peptides，CSP）的研究卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期篩選出的最佳酶及最佳酶解條件的基礎(chǔ)上，以青蛤?yàn)樵希ㄟ^胃蛋白酶酶解和超濾的方法制備青蛤多肽，而后根據(jù)其對RAW264.7巨噬細(xì)胞生長與增殖、細(xì)胞形態(tài)、吞噬作用、一氧化氮（nitric oxide，NO）分泌和細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞周期的影響，評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)作用，以期為青蛤多肽的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蛤 舟山市老碶菜場；小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中科院上海細(xì)胞所。

胃蛋白酶 亞太恒信科技中心（北京）有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；NO試劑盒、白介素（interleukin，IL）-1β試劑盒、IL-6試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）試劑盒 南京建成生物工程研究所；中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒 上海貝博生物。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1209C型超凈工作臺(tái) 上海智誠分析儀器制造公司；Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；CKX4型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；CF16RXⅡ型高速低溫離心機(jī) 日本日立公司；Easy Cyte6 HT-2L流式細(xì)胞儀 美國Millipore公司；ALPHA 1-4/LD plus型冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；BONA-GM-18型納濾膜分離實(shí)驗(yàn)機(jī) 濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7于DMEM高糖培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗）中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)進(jìn)行傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CSP酶解液的制備

青蛤去殼取肉，洗凈，勻漿并用異丙醇脫脂6 h，于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集沉淀洗凈備用；稱取適量的沉淀，根據(jù)前期篩選出的最佳酶種及最佳酶解條件，選用胃蛋白酶，在溫度42 ℃、pH 2.0、料液比1∶10、加酶量1 600 U/g條件下酶解8 h；酶解完成后于沸水中水浴15 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，仔細(xì)收集上清液即為CSP酶解液。

1.3.3 超濾酶解液的制備

選取孔徑為30、10、5 kDa和3 kDa的超濾膜對1.3.2節(jié)所得的CSP酶解液超濾，收集大于30 kDa、10～30 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa、小于3 kDa 5 個(gè)分子質(zhì)量段的超濾液分別命名為CSP-1、CSP-2、CSP-3、CSP-4、CSP-5，再將CSP-5組分經(jīng)孔徑為150 Da的納濾膜進(jìn)行脫鹽處理。冷凍干燥后，以100 μg/mL的質(zhì)量濃度，采用MTT法檢測各組分對RAW264.7細(xì)胞生長與增殖的影響，同時(shí)設(shè)置空白對照組（完全培養(yǎng)液、細(xì)胞），篩選出與空白對照組相比，相對增殖率最高的組分進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用研究。參考陳榕芳等[9]的方法，按公式（1）計(jì)算RAW264.7細(xì)胞的相對增殖率。

1.3.4 CSP對RAW264.7巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究

1.3.4.1 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

參照Deng Chao等[10]的方法，并稍作修改。細(xì)胞濃度約為1×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后棄去培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、100、50、25、12.5 μg/mL的CSP，同時(shí)設(shè)置空白對照組（完全培養(yǎng)液、細(xì)胞）和1 μg/mL的LPS陽性對照組；孵育36 h后吸去上清液，每孔加入200 μL 5 mg/mL MTT，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；吸出上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定OD值，按公式（1）計(jì)算相對增殖率，根據(jù)相對增殖率的大小確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所選取的CSP質(zhì)量濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)。

1.3.4.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞濃度約為1×104個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后，吸出培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度分別為100、50、25 μg/mL的CSP，以LPS（1 μg/mL）為陽性對照組，同時(shí)設(shè)置空白對照組；孵育36 h后，用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4.3 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)

參照Yu Jie等[11]的方法，并稍作修改。細(xì)胞濃度約為1×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后，吸出培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為100、50、25 μg/mL的CSP，同時(shí)設(shè)置LPS（1 μg/mL）陽性對照組和空白對照組；孵育36 h后，吸出上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次，每孔加入不含NaHCO3的培養(yǎng)液180 μL和中性紅染液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h；棄除上清液，再用PBS洗滌2 次，每孔加入200 μL裂解液，室溫?fù)u床裂解10 min，用酶標(biāo)儀在540 nm波長處測定OD值，按公式（2）計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.3.4.4 CSP對RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

參照Lee等[12]的方法，并稍作修改。實(shí)驗(yàn)分組及前期處理步驟同1.3.4.3節(jié)，各組分別加藥物培養(yǎng)36 h后，收集上清液，按試劑盒要求操作，測定各組份中NO的分泌量。

1.3.4.5 CSP對RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量的影響

實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞前期處理步驟與1.3.4.3節(jié)相同，各組分別加入藥物培養(yǎng)36 h后，用無菌管收集培養(yǎng)上清液；2 000～3 000 r/min離心20 min，再次收集上清液，并按酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒要求操作，檢測各組上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的含量。

1.3.4.6 CSP對RAW264.7細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞濃度約為1×104個(gè)/mL，每瓶2 mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，12 h后吸出培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為100、50、25 μg/mL的CSP，同時(shí)設(shè)置LPS（1 μg/mL）陽性對照組和空白對照組，繼續(xù)孵育36 h；棄去營養(yǎng)液，用PBS洗滌2 次，吹散細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min收集；加入冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液再次吹散細(xì)胞，放入-20 ℃固定1 h；離心除去乙醇，PBS洗滌2 次，300 μL冷的PBS重懸細(xì)胞；加入RNase A溶液20 μL，37 ℃水浴30 min，400 目篩網(wǎng)過濾；加入碘化丙啶染液400 μL，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測其結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CSP超濾組分對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

圖1 CSP超濾組分對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effects of CSP ultrafiltration fractions on the proliferation of RAW264.7 cells

從圖1中可看出，CSP各超濾組分對RAW264.7細(xì)胞的增殖都有一定的促進(jìn)作用；與空白對照組相比，CSP-1組分對RAW264.7細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用具有顯著性差異（P＜0.05）；CSP-3、CSP-4、CSP-5組分對RAW264.7細(xì)胞的促進(jìn)作用具有極顯著性差異（P＜0.01），且CSP-5組分對RAW264.7細(xì)胞的相對增殖率最高，因此選擇CSP-5進(jìn)一步研究。

2.2 CSP-5對RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

2.2.1 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，LPS和CSP-5均能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，但當(dāng)CSP-5質(zhì)量濃度過高或過低時(shí)對細(xì)胞增殖的影響并無顯著性差異。當(dāng)CSP-5質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，對RAW264.7細(xì)胞增殖影響顯著（P＜0.05）；當(dāng)CSP-5質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響極顯著（P＜0.01），且相對增殖率最大為（97.56±5.26）%。隨著CSP-5質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，相對增殖率開始驟降。當(dāng)質(zhì)量濃度升至250 μg/mL時(shí)，與空白對照組相比，CSP-5對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇100、50、25 μg/mL CSP-5進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的進(jìn)一步研究。

圖2 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of CSP-5 on the proliferation of RAW264.7 cells

2.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

圖3 倒置顯微鏡觀察RAW264.7細(xì)胞形態(tài)（×400）Fig. 3 Morphology of RAW264.7 cells observed by inverted microscope (× 400)

由圖3可看出，與空白組相比，經(jīng)CSP-5和LPS處理后的細(xì)胞在形態(tài)和數(shù)目上都發(fā)生了明顯的變化。空白對照組細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞排列緊密且形態(tài)良好，無明顯突起及棱角；經(jīng)CSP-5作用后，細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增加，且隨著CSP-5質(zhì)量濃度的增加，分化及出現(xiàn)偽足的細(xì)胞數(shù)也明顯增加；100 μg/mL CSP-5組RAW264.7細(xì)胞的個(gè)數(shù)與LPS組相當(dāng)，且部分細(xì)胞已開始分化，呈現(xiàn)不規(guī)則形狀。

2.2.3 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，與空白對照組相比，LPS和CSP-5均能顯著性增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，CSP-5對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的刺激作用也在不斷地增加；當(dāng)質(zhì)量濃度增至100 μg/mL時(shí)，吞噬指數(shù)達(dá)到2.17±0.04，表明CSP-5能有效激活RAW264.7細(xì)胞，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

圖4 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig. 4 Effect of different concentrations of CSP-5 on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.2.4 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

表1 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響（n＝3）Table 1 Effect of different concentrations of CSP-5 on NO secretion in RAW264.7 cells (n= 3)

由表1可知，CSP-5對RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的刺激作用呈劑量相關(guān)性，CSP-5質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞NO的分泌量無明顯增加；CSP-5質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞NO分泌量的增加具有顯著性差異（P＜0.05）；CSP-5質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞NO分泌量的增加具有極顯著性差異（P＜0.01），但弱于LPS組。

2.2.5 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌量的影響

圖5 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）分泌量的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of CSP-5 on the secretion of IL-1β (A), IL-6 (B) and TNF-α (C) in RAW264.7 cells

由圖5可看出，CSP-5對RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子分泌量的影響具有劑量相關(guān)性。經(jīng)50、1 0 0 μ g/m L C S P-5處理后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子I L-1 β、I L-6和T N F-α的分泌量與空白對照組相比都極顯著性增加（P＜0.01）；而當(dāng)CSP-5質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)上清液中IL-1β的分泌量已高于LPS陽性對照組，且細(xì)胞因子IL-6的分泌量也與其相當(dāng)。

2.2.6 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞周期的影響

圖6 RAW264.7細(xì)胞周期的變化Fig. 6 Changes in cell cycle of RAW264.7 cells

圖7 CSP-5對RAW264.7細(xì)胞周期的影響Fig. 7 Effect of different concentrations of CSP-5 on cell cycle of RAW264.7 cells

由圖6、7可知，與空白對照組相比，經(jīng)CSP-5刺激36 h后處于G0/G1期的細(xì)胞比例有所上升，處于S期及G2/M期的細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中的占比有所下降，且占比變化趨勢呈劑量相關(guān)性。CSP-5低質(zhì)量濃度時(shí)各期的比例與空白對照組相比無明顯變化，當(dāng)CSP-5質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)各期的變化趨勢接近于LPS陽性對照組。

3 討 論

免疫系統(tǒng)是一種存在于所有脊椎動(dòng)物中復(fù)雜的防御系統(tǒng)，由多種器官、組織、細(xì)胞及因子組成，涉及多種疾病（如腫瘤的發(fā)生，細(xì)菌、病菌的感染）的病因?qū)W及病理生理學(xué)機(jī)制，分為先天免疫和適應(yīng)性免疫[19-20]。先天免疫是機(jī)體識(shí)別“自我”和“非自我”，清除異物，保護(hù)機(jī)體健康的第一步[21]，其主要由巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及多種單核細(xì)胞組成，且在抵御細(xì)菌或病毒感染以及組織炎癥時(shí)能不斷地自我進(jìn)化[22]。免疫組成細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞有著獨(dú)一無二的作用，具有多種生物學(xué)功能如吞噬、監(jiān)視及靶向生物體的破壞等，是激活先天免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要橋梁[23-24]，因此巨噬細(xì)胞也常作為免疫調(diào)節(jié)模型來評(píng)價(jià)活性物質(zhì)在免疫調(diào)節(jié)方面所具有的生物學(xué)作用。RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞系曾被用來描述各種活性物質(zhì)在分子水平的免疫調(diào)節(jié)作用[25]；故本實(shí)驗(yàn)以RAW264.7巨噬細(xì)胞為模型，研究青蛤多肽在體外的免疫調(diào)節(jié)活性。

免疫調(diào)節(jié)是指在免疫調(diào)節(jié)劑的參與下，免疫系統(tǒng)對自身免疫應(yīng)答控制和調(diào)節(jié)的過程，其目的是保持機(jī)體的穩(wěn)定和內(nèi)平衡。其中多肽因具有生物活性高、毒性低、易吸收等特點(diǎn)，近年來在免疫調(diào)節(jié)劑開發(fā)等方面受到了越來越多國內(nèi)外研究者的重視。卜天等[26]采用MTT法，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性為指標(biāo)，篩選出溫度62.5 ℃、pH 9.5、加酶量0.08%、酶解時(shí)間8 h為胰蛋白酶水解蝦蛄的最佳酶解條件；中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為20、25 mg/mL的條件下，蝦蛄多肽對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的增強(qiáng)具有顯著的作用。紀(jì)麗娜[27]用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解金槍魚頭肉，經(jīng)分離純化后作用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明0.01 mg/mL的酶解液對于巨噬細(xì)胞活性和吞噬功能的增強(qiáng)均具有顯著的效果；Griess法和ELISA法檢測結(jié)果顯示，酶解液對于巨噬細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6分泌的影響均無顯著性差異。Wu Wenjia等[28]采用酶解的方法，經(jīng)分離純化后從麥胚球蛋白中制備出一種新型寡肽（Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala），當(dāng)質(zhì)量濃度為20、40、80 μg/mL時(shí)，此寡肽能通過TLR2和TLR4模式識(shí)別受體激活巨噬細(xì)胞RAW264.7，巨噬細(xì)胞被激活后，其吞噬能力顯著增強(qiáng)，且NO、IL-6、TNF-α和活性氧的分泌量也顯著增加。多肽生物活性的影響因素主要有氨基酸序列、肽鏈的長度及分子質(zhì)量等，且多數(shù)研究結(jié)果表明，小分子肽較大分子肽具有更強(qiáng)的生物活性[29-30]，這可能與小分子肽在體內(nèi)易吸收、不易被破壞等優(yōu)勢相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中CSP-1為酶解液中分子質(zhì)量大于30 kDa的所有物質(zhì)，不是單一的組分，其對于RAW264.7細(xì)胞的增殖效果優(yōu)于CSP-2可能是由于各組分之間協(xié)同作用的結(jié)果，而CSP-2為分子質(zhì)量在10～30 kDa的組分，成分相對單一，免疫活性物質(zhì)的含量可能相對較少，所以作用效果不如CSP-1混合組分高。

LPS為革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的病原體，具有激活巨噬細(xì)胞、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用，在免疫調(diào)節(jié)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中常作為陽性對照出現(xiàn)[31]。活化后的巨噬細(xì)胞其吞噬能力明顯增強(qiáng)，且能分泌大量生物活性物質(zhì)如NO和多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等[32-33]；因此，巨噬細(xì)胞的吞噬功能、NO及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌量可作為評(píng)價(jià)CSP是否具有激活巨噬細(xì)胞從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。巨噬細(xì)胞作為吞噬細(xì)胞，其活性衡量的一項(xiàng)重要依據(jù)就是吞噬能力的大小[34]，而中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)是檢測其吞噬能力常用的方法[35]；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)CSP-5作用后RAW264.7細(xì)胞的吞噬作用與空白對照組相比明顯增強(qiáng)，且與LPS作用后的細(xì)胞變化趨勢保持一致。NO是精氨酸通過一氧化氮合酶合成的重要炎癥介質(zhì)，也是巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能的基本條件[36]；經(jīng)LPS和CSP-5作用后巨噬細(xì)胞NO分泌量也明顯增加，與其吞噬增強(qiáng)的研究結(jié)果相吻合。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CSP-5的免疫調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)還檢測了RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。細(xì)胞因子作為一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，在機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向炎癥部位移動(dòng)，且有助于機(jī)體適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生，預(yù)防炎癥的惡化及組織損傷；由圖4、5可知，經(jīng)CSP-5作用后，RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力得到了明顯的增強(qiáng)，作用效果呈劑量相關(guān)性，低劑量時(shí)促進(jìn)作用不明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，促進(jìn)作用接近于陽性對照組，這表明CSP-5具有增強(qiáng)炎性因子分泌的作用。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了細(xì)胞周期相關(guān)研究，研究結(jié)果表明，隨著CSP-5質(zhì)量濃度的增加，處于G0/G1期的細(xì)胞比例上升，S期比例有所下降，由此可得，經(jīng)CSP-5作用后的巨噬細(xì)胞主要在G0/G1期發(fā)生增殖，而G0/G1期也是RNA及蛋白質(zhì)的合成期；因相關(guān)蛋白的表達(dá)量增加，所以其吞噬、NO及細(xì)胞因子的分泌能力也的到了相應(yīng)的增強(qiáng)。綜上所述，CSP-5具有激活巨噬細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的潛在作用。