24-表油菜素內酯對杏果實采后抗冷性與可溶性糖含量的影響

張杼潤，張瑞杰，趙 津，朱 璇*

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

杏（Prunus armeniaca L.）在新疆園藝產業中占重要地位。2016年，新疆杏種植面積達1.24×109m2,產量達1.15×106t[1]。杏屬呼吸躍變型果實，常溫下易發生腐敗變質。低溫貯藏雖可有效抑制杏果實采后腐爛，但會導致冷敏性果實杏發生生理紊亂，出現冷害現象[2]。研究發現，可溶性糖不僅能通過調節蛋白質合成來作為植物生長控制的基礎[3]，還可作為活性氧清除劑，維持細胞內活性氧平衡，對植物抗低溫逆境起重要作用[4-5]。如紅樹莓中糖的積累能增強其抗冷害逆境耐受力[6]。近幾年來，糖在植物抗冷害脅迫中起到的調節作用成為研究熱點。

油菜素內酯是一種新型甾體植物生長激素，它能充分激發植物內在潛能，促進生長，增加產量，同時提高植物的抗寒、抗病、抗鹽等能力，使植物的耐逆性增強，被認為是第六大類植物激素[7-8]。但從植物中提取油菜素內酯工藝復雜，成本昂貴，所以更多使用的是利用麥角甾醇等天然甾體化合物改造合成的油菜素甾體化合物產品，24-表油菜素內酯（24-epibrassinolide，EBR）就是其中一種[9]。目前，針對EBR的研究更多地集中于大豆[10]、黑麥草[11]的抗鹽脅迫，葡萄葉片[12]的抗病害脅迫，及番茄植株[13]的抗弱光脅迫等積極作用，近年來研究也證實了EBR能對桃[14]、茄子[15]果實冷害進行有效控制，關注點多在冷害控制效果與活性氧代謝的研究上，但EBR對果實糖含量和冷害關系的影響鮮見報道。

本研究以新疆‘賽買提’杏為實驗材料，探究EBR對杏果實冷害發生情況與可溶性糖含量變化及其關系的影響，為完善低溫脅迫下可溶性糖對果實的保護機制和采后果實低溫適應性誘導提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆‘賽買提’杏采自于新疆庫車縣烏恰鎮杏果園。杏果實硬度用GY-B型果實硬度計（探頭直徑4 mm）在果實赤道部位等距離取3個點測定并取平均值，可溶性固形物質量分數用WYT-J型手持糖度儀進行測定，選取硬度在13～15 kg/cm2，可溶性固形物質量分數在10%～12%之間、無病蟲害、無機械損傷的果實，采摘后于12 h之內運回新疆農業大學果蔬采后生理研究室。

蔗糖、葡萄糖、山梨醇、果糖標準品及乙腈（色譜純） 美國Sigma公司；EBR（粉劑，純度≥90%）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統（配有RID-10A示差折光檢測器和LabSolutionsLCsolution色譜工作站） 日本島津公司；GL-20G-2高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 北京永光明儀器廠；DDS-307電導率儀 上海精密科學儀器有限公司；KQ-250DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

根據前期預實驗，在0～2 mg/L范圍內，質量濃度0.9 mg/L的EBR溶液處理后，‘賽買提’杏冷藏期間各品質指標表現最優，質量濃度過高會加快果實腐爛；因此選擇0.9 mg/L作為本實驗處理的質量濃度。用減壓滲透[16]的方式處理杏果實，將浸泡有杏果實的EBR溶液抽氣減壓至0.05 MPa保持2 min，之后恢復常壓繼續浸泡5 min，自然晾干后置于溫度為0 ℃、相對濕度為90%～95%的冷庫貯藏。以蒸餾水處理作為對照組，每處理選用300 個杏果實，重復3 次。

1.3.2 冷害指數測定

參照Wang Zhen等[17]的方法，將杏果實冷害分為5 級。其中，0級：無冷害發生；1級：冷害面積0～5%之間；2級：冷害面積5%～25%之間；3級：冷害面積25%～50%之間；4級：冷害面積大于50%；按公式（1）計算冷害指數。每處理觀察100 個杏果實，重復3 次，總共統計樣本量為300 個杏果實。

1.3.3 冷害發病率測定

以單個果實冷害程度達1級及以上計為發病果，按式（2）計算冷害發病率。每處理觀察100 個杏果實，重復3 次，總共統計樣本量為300 個杏果實。

1.3.4 細胞膜透性測定

使用打孔器（直徑5 mm）取杏果肉并切成厚度約2 mm圓片，測定新鮮圓片浸提液的電導率（L1）和煮沸后果實圓片的電導率（L0），按式（3）計算的比值即相對電導率（Le），以相對電導率來表示細胞膜滲透率，每處理選果3 個，重復3 次。

1.3.5 MDA含量測定

參照曹建康等[18]的方法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.3.6 可溶性糖含量測定

采用HPLC測定可溶性糖含量。提取方法：稱取2.00 g杏果肉樣品，加入4.00 mL超純水冰浴研磨勻漿，后用2.00 mL超純水清洗研缽，轉入到離心管中，先超聲提取5 min后轉入水浴鍋80 ℃提取15 min，10 000×g離心20 min后取上清液，殘渣加超純水后重復以上步驟一次，合并上清液，定容于25 mL容量瓶，過0.45 μm濾膜，備用。每處理選果3 個，重復3 次。

測定條件：流動相為乙腈-水（體積比75∶25），流速為1 mL/min，柱溫50 ℃，進樣體積20 μL，分析時長15 min。檢測器：RID-10A示差折光檢測器，色譜柱：Kromasil氨基色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

標準曲線的制作：分別準確稱取100 mg蔗糖、葡萄糖、山梨醇、果糖標準品，用超純水定容至10 mL，配制質量濃度為10.00 mg/mL的混合標準品母液，梯度稀釋至5.00、2.50、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL的標準溶液，經0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.4 數據處理

采用Excel 2007軟件和SPSS 19.0軟件進行數據分析。差異顯著性分析方法用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 EBR處理對杏果實冷藏期間冷害指數、冷害發病率的影響

圖1 EBR處理對杏果實冷害指數（A）和冷害發病率（B）的影響Fig. 1 Effect of EBR treatment on chilling injury index (A) and chilling injury rate (B) of apricots

如圖1A所示，對照組在貯藏第21天出現冷害癥狀，EBR處理組較對照組推后7 d出現冷害現象。隨著貯藏時間延長，對照組與處理組冷害指數均呈現上升趨勢，且處理組杏果實冷害指數始終低于對照組。到貯藏第42天時，EBR處理組冷害指數比對照組低24.2%（P＜0.05）。說明EBR處理可明顯降低杏果實貯藏期間冷害指數。

由圖1B可知，整個貯藏期EBR處理杏果實冷害發病率始終低于對照組，到貯藏期結束時，對照組杏果實冷害發病率為42.3%，EBR處理組為31.5%，比對照組低25.5%（P＜0.05）。說明EBR處理可有效抑制杏果實冷害發病率，延緩杏果實冷害的發生。

2.2 EBR處理對杏果實冷藏期間細胞膜滲透率、MDA含量的影響

圖2 EBR處理對杏果實細胞膜滲透率（A）和MDA含量（B）的影響Fig. 2 Effect of EBR treatment on cell membrane permeability (A) and malondialdehyde content (B) of apricots

果蔬組織受到低溫脅迫時，細胞膜結構與功能都受到影響，往往表現為細胞膜透性增加和電解質外滲[19]，由圖2A可知，EBR處理后杏果實細胞膜滲透率總體呈現上升趨勢，且處理組始終顯著低于對照組（P＜0.05），在第28、42天分別比對照組低16.8%、17.4%，說明EBR處理可保護細胞膜結構完整性，有效抑制杏果實冷害的發生。

MDA是膜脂過氧化的產物之一[20]，由圖2B可知，整個低溫貯藏期間EBR處理組MDA含量始終低于對照組，到第28天時，EBR處理組與對照組MDA含量分別達到0.68、0.84 nmol/g，隨后差距逐漸加大，到貯藏期結束時EBR處理組MDA含量比對照組低22.3%（P＜0.05）。表明EBR處理能有效抑制杏果實冷藏期間膜脂過氧化進程，從而延緩衰老。

2.3 EBR處理對杏果實冷藏期間可溶性糖含量的影響

由圖3可知，標準樣中各組分依次的出峰順序為果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，保留時間分別7.298、8.048、8.532、11.686 min。樣品可溶性糖HPLC結果見圖4。

圖3 糖混合標準品的HPLC圖Fig. 3 High performance liquid chromatogram of mixed saccharide standards

圖4 鮮杏果實樣品可溶性糖成分的HPLC圖Fig. 4 High performance liquid chromatogram of soluble saccharides in apricots

圖5 EBR處理對杏果實果糖（A）、山梨醇（B）、葡萄糖（C）、蔗糖（D）含量的影響Fig. 5 Effect of EBR treatment on the contents of fructose (A),sorbitol (B), glucose (C) and sucrose (D) in apricots

如圖5A所示，果糖含量在整個貯藏期間呈現不斷上升的趨勢，且EBR處理組杏果實果糖含量始終高于對照組。在貯藏前期，果糖含量保持平緩上升，對照組在21 d后，上升幅度陡然增大，而EBR處理組則推遲7 d后上升幅度顯著加大。第35、42天時，處理組果糖含量分別比對照組高49.5%和19.4%（P＜0.05）。表明EBR處理可明顯增加低溫貯藏期間杏果實果糖含量。

杏果實貯藏中后期（14～21 d）EBR處理組與對照組山梨醇含量變化趨勢相同（圖5B），呈降-升-降的趨勢，且EBR處理組含量始終高于對照組，在第7天時出現最大差異，此時處理組比對照組高18.2%（P＜0.05），貯藏到42 d時，EBR處理組與對照組山梨醇含量均達到最低，表明EBR處理可增加杏果貯藏期間山梨醇含量，但貯藏結束時，兩組山梨醇含量比初始均稍有下降。

葡萄糖含量經EBR處理后在貯藏前期無明顯變化（圖5C），21 d后逐漸增大，直到貯藏結束時達到47.4 g/kg。對照組果實葡萄糖含量在冷藏開始時先逐步下降，14 d時達最低值后緩慢上升，到貯藏結束時比EBR處理組低31.2%（P＜0.05）。表明EBR處理可顯著增加低溫貯藏期間杏果實葡萄糖含量。

蔗糖含量變化與其他糖分相反（圖5D），EBR處理后蔗糖含量始終低于對照組。0 d時兩組蔗糖含量為28.8 g/kg，到第7天時，EBR處理組蔗糖含量上升到40.4 g/kg，低于對照組7.8%（P＜0.05），隨后下降到最低值22.1 g/kg（21 d時），低于對照組9.7%（P＜0.05），之后緩慢上升，到貯藏結束時低于對照組13.1%（P＜0.05）。對照組變化趨勢與處理組相同。

3 討 論

可溶性糖是影響果實風味與質量的重要因素之一[21]。在本研究中測得杏果實中可溶性糖主要有果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖，與前人實驗結果[22]類似。EBR處理增加了杏果實冷藏期間果糖、山梨醇和葡萄糖含量，EBR處理對杏果實冷藏期間品質的保持起到積極作用。李園園[23]、柳巧禛[24]等的研究也表明EBR處理保持了草莓、‘赤霞珠’葡萄果實的貯藏品質。同時，EBR處理明顯降低了杏果實冷藏期間冷害指數、冷害發病率、MDA含量與細胞膜滲透率，有效抑制了杏果實冷害的發生，而可溶性糖除了是果實品質的重要組成，對保護果實免受冷應激損傷同樣起重要作用。已有的研究表明，桃在5 ℃貯藏28 d時出現冷害現象，較沒出現冷害的0 ℃貯藏果實表現出更低的蔗糖含量和較高的葡萄糖和果糖含量[25]；1 ℃貯藏時冷害較輕的‘寧海白’枇杷比冷害嚴重的‘大紅袍’枇杷葡萄糖、果糖含量高[26]；一氧化氮（NO）熏蒸李果實較非熏蒸組，果糖和葡萄糖含量增高，蔗糖含量降低，冷害癥狀顯著降低[27]。山梨醇代謝在薔薇科植物中起重要作用，已有研究發現蘋果抗寒性與山梨醇含量呈正相關[28]。以上結論均證實糖在采后果實抗低溫逆境脅迫中起重要作用。

氧化應激反應是誘導細胞損傷的關鍵因素之一，一方面葡萄糖與果糖作為主要還原糖，其積累可以緩解氧化應激反應，提高膜的穩定性，抵抗低溫脅迫造成的損傷[29]。其中葡萄糖可通過戊糖磷酸途徑清除活性氧[30]，還可作為抗壞血酸合成的前體物，誘導抗壞血酸-谷胱甘肽循環減緩果實冷害的發生[31]，這在桃[25]、枇杷[32]、芒果[33]中已經得到證實。而生物膜系統的損傷在膜脂相變理論[34]中是植物遭受低溫逆境時的原初反應，這將導致胞內物質的損失與電解質滲透及膜脂過氧化的增加。另一方面，糖物質積累可調節滲透勢，維持細胞滲透壓平衡，保持細胞水分，穩定磷脂雙分子層的原始結構，減輕低溫對生物膜的損傷[35]。MDA是膜脂過氧化的產物，過多的MDA會影響膜結構穩定，擾亂正常的生理代謝[20]。在本研究中EBR在提高果糖、山梨醇和葡萄糖含量的同時降低MDA含量與細胞膜滲透率，緩解了冷害的發生。

在本研究中，杏果實經EBR處理后蔗糖含量有所下降，Wang Zhen等[17]針對鮮食吊干杏的研究表明，草酸處理能降低蔗糖含量和冷害發生，與本研究結論相似。Shao Xingfeng等[32]研究表明，熱處理后枇杷果實冷藏期間蔗糖含量降低，冷害程度減輕；而Holland等[36]則研究得出熱處理可增加蔗糖含量而減輕冷藏期間橘子冷害的發生。因此，關于蔗糖在植物抗冷害中起的作用可能因果實品種、成熟度等的不同有所變化，至于哪一種糖在抗低溫脅迫中起最重要作用尚未定論。

果實低溫貯藏期間不同類型糖的變化模式非常復雜，糖對抗冷脅迫的調控機理尚不明確，還需應用分子技術，研究糖代謝中關鍵酶的基因組學與相關蛋白表達，進一步探討糖作為信號分子對果實抗低溫的調控作用，以此為農業產業發展提供助力。

本研究表明，EBR處理可明顯降低杏果實低溫貯藏期間冷害指數、冷害發病率與MDA含量、細胞膜透性，增強杏果實抗冷性，這可能與果糖、山梨醇、葡萄糖含量的增加密切相關。