納米抗菌包裝材料對延緩白蓮藕風味品質劣變的影響

孫世旭，李 莉，韓祥穩，周 游，曹崇江*

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210003）

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）是我國重要的水生蔬菜，主要分布在長江三角洲、珠江三角洲、洞庭湖等地，含有豐富的蛋白質、碳水化合物、礦物質、維生素等營養物質[1-2]。蓮藕屬于水生植物，含水量高，表皮非常薄，容易受到損傷，而且采收后，由于生存條件的改變，由“水生”變為“陸生”，生理變化加劇，嚴重影響蓮藕的貯藏品質[3]，進而影響蓮藕的風味。目前對于蓮藕的研究主要集中于貯藏方式的研究，蓮藕的貯藏方式包括SO2熏蒸、隔離氧氣、氣調包裝及低溫貯藏等，但這些方法存在著食品安全性、價格較高以及貯藏效果一般等問題。

隨著人們對果蔬保鮮要求的不斷提高，如何改變、提升包裝材料性能成為專家學者們研究的又一個熱點問題，而納米技術的出現為解決這個問題提供了方法。納米技術使傳統的包裝材料不僅具有優良的物化性能，如高阻氣、阻濕性、較高的耐磨性、較高的強度和韌性等，同時具有較好的成型性。利用納米抗菌包裝材料具有的特殊優秀性能，結合各種食品保鮮的特性及材料要求，在蔬菜、水果、肉制品及奶制品方面取得了較好的貯藏效果[4-6]，但納米包裝對于蓮藕采后品質的研究尚鮮見報道。

風味作為評價食品品質的重要指標越來越受到人們的關注。近年來對風味的研究主要集中在加工處理方式對風味品質的影響。汪薇等[7]研究了超高壓靜水處理對鮮切蓮藕貯藏品質的影響，結果表明采用超高壓方法處理鮮切蓮藕真空包裝產品，可以延緩鮮切蓮藕的品質劣變。劉春菊等[8]建立了冷凍蓮藕貯藏期間品質變化動態模型，結果表明冷凍處理的蓮藕可以保持蓮藕原有的大部分品質風味。但不同包裝對于蓮藕貯藏期間風味影響的研究極少。

本實驗采用納米抗菌包裝材料對白蓮藕進行真空包裝貯藏，研究貯藏期間納米抗菌包裝對白蓮藕揮發性組分及相關基因的影響，以期闡明納米抗菌包裝材料對白蓮藕揮發性組分的影響，為白蓮藕采后貯運中的衰老調控提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蓮藕購于南京市棲霞區南京郵電廣場菜市場，選取大小均一、無機械損傷的蓮藕，將表面清洗干凈后進行包裝處理。普通包裝材料由揚州天成食品公司惠贈。

三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）、福林-酚試劑、偶聯劑、潤滑劑、分散劑 國藥集團化學試劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；植物RNA提取試劑盒 北京華越洋生物科技有限公司；反轉錄cDNA試劑盒 日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

人工氣候箱 寧波江南儀器設備有限公司；Allegra 64R冷凍離心機 美國Beckman公司；全波長酶標儀SpectraMax 190 南京百奧生物科技有限公司；FOX 3000電子鼻系統 法國Alpha MOS公司；AJ-320智能真空保鮮機 廣東省東莞市益健包裝機械有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀 美國安捷倫公司；固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）頭美國Suplco公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 納米抗菌包裝材料的制備

納米抗菌粉體制備：配制20 mg/L的銀氨溶液，在pH 10條件下加入納米SiO2，振蕩1 h，使得Ag通過強靜電吸附在SiO2表面晶格中，離心后室溫干燥，再經紫外照射1 h后制備成具有抗菌性的Ag/SiO2粉體[9]。

納米抗菌包裝材料的制備：首先將30%（質量分數，下同）Ag/SiO2抗菌粉體、25%凹凸棒土、10%納米SiO2及35%納米TiO2制備成納米復合粉體；將15.55%納米復合粉體、2%偶聯劑、1%潤滑劑、9%分散劑、49.01%低密度聚乙烯與23.44%線性低密度聚乙烯制備成納米母粒；然后，將7.5%納米母粒、92.5%復合塑料粒子吹塑成納米包裝材料。厚度與普通包裝材料一致，均為0.1 mm。

1.3.2 貯藏條件

分別取一節完整的白蓮藕包裝進普通包裝袋及納米抗菌包裝袋中，兩種包裝袋各包裝5 袋并抽真空。將人工氣候箱的條件設置為室溫環境，溫度25 ℃、相對濕度35%，每隔4 d取樣測定。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 電子鼻測定

取6 g白蓮藕于20 mL密封樣品瓶，使用配備12 種MOS傳感器類型（表1）的電子鼻系統對樣品進行檢測[10]，做3 次平行實驗。

表1 FOX3000型電子鼻MOS傳感器的敏感性和分離性Table 1 Information about MOS sensors used in model FOX3000 electronic nose

電子鼻檢測條件：載氣為干燥潔凈空氣，頂空生產時間40 s，頂空生產溫度120 ℃，進樣量1 000 μL，注射器溫度50 ℃，攪拌速率500 r/min，數據采集延遲時間60 s，數據采集時間600 s。

1.3.3.2 GC-MS分析

將白蓮藕搗碎勻漿后準確稱取10.0 g放入20 mL的頂空瓶中，置于40 ℃恒溫水浴鍋中平衡30 min后將SPME萃取頭深入頂空瓶，伸出萃取頭中的纖維萃取40 min，縮回纖維、拔針，最后將萃取頭插入GC進樣口，伸出纖維，解吸5 min即可，每次解吸之后萃取頭需老化20 min[11]。

GC條件：DB-5毛細管色譜柱（30.0 m×0.25 mm，0.5 μm），進樣口溫度為250 ℃，載氣為He，流速為1.0 mL/min，不分流進樣；升溫程序：柱溫35 ℃，保持5 min，以7 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃保持5 min。

MS條件：離子源為EI源，能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃，質量掃描范圍40～550 amu。

化合物鑒定及定量定性分析：樣品揮發性化合物經GC分離，不同組分形成其各自的色譜峰，用GC-MS儀進行分析鑒定。分析結果運用計算機譜庫（NIST/WILEY）進行初步檢索及資料分析，再結合文獻進行人工譜圖解析，確認揮發性化合物的各個化學成分。化合物相對含量確定采用面積歸一法。

1.3.3.3 總酚含量的測定

總酚的提取：取3.0 g白蓮藕，磨碎，按料液比1∶22（m/V）加入體積分數40%的乙醇，用乙酸調節pH值至3，置于40 ℃、200 W的超聲場中浸提72 min，過濾，分離濾液，定容至100 mL，混勻后測定總酚含量[12]。

總酚含量的測定：移取0.125 mL提取液，加入0.5 mL蒸餾水和0.125 mL福林-酚試劑，混勻后25 ℃下靜置反應6 min。再加入1.25 mL 7 g/L碳酸鈉溶液和1 mL蒸餾水混勻后在25 ℃下避光靜置90 min。取0.175 mL上清液于96 孔板中，在760 nm波長處測定吸光度并且用0.125 mL甲醇替代提取液做空白對照，結果以干質量計。

1.3.3.4 丙二醛含量的測定

使用TBA法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。稱取2.0 g樣品，加入5.0 mL 5 g/100 mL三氯乙酸溶液，在冰浴的條件下用研缽研磨成漿后，10 000 r/min離心20 min。取上清液2.0 mL，加入2.0 mL 0.67 g/100 mL TBA溶液，混勻后沸水浴30 min。冷卻，取上清液0.175 mL于96 孔板中，測定在450、532、600 nm波長處的吸光度，根據下式計算MDA的含量[13]，結果以濕質量計。

1.3.3.5 SOD、CAT活力的測定

SOD、CAT活力分別采用SOD、CAT試劑盒測定。在37 ℃條件下，每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為1 個酶活力單位（U）。蛋白質量濃度的測定：取樣品0.5 g用5 mL蒸餾水研磨后3 000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL于試管中，加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250溶液充分混合，放置2 min后在595 nm波長處比色，通過標準曲線計算蛋白質量濃度。

1.3.3.6 蓮藕轉錄組序列分析

2.3.2 第2輪專家咨詢結果。3名專家對1級、2級指標未提出異議。在3級指標中，1名專家提出胎兒情況中胎心異常，羊水有污染與無污染的處理方式不同，建議增加“胎心異常、羊水無污染”;2名專家提出“腹壓的使用”和“宮縮強度”中共6項3級指標表述不清，存在歧義。通過課題組的討論，增加“胎心異常、羊水無污染”，修改6項存在歧義的3級指標，分別為“在助產士指令下，不能有效地使用腹壓”、“在助產士指令下，較好地使用腹壓”、“在助產士指令下，有效地使用腹壓”、“過弱”、“過強”和“適中”。

表2 引物序列表Table 2 Primer sequences used in this study

對普通包裝貯藏和納米抗菌包裝貯藏20 d的白蓮藕進行取樣，每組稱取100 mg，在液氮中進行粉碎研磨。研磨后的白蓮藕樣品，利用RNA提取試劑盒進行RNA提取。用于蓮藕轉錄組測序的RNA樣品要代表普通包裝貯藏和納米抗菌包裝貯藏20 d的白蓮藕RNA，因此多次提取各處理組的RNA后，分別混合各處理組的RNA。白蓮藕轉錄組測序委托北京諾禾致源基因測序公司進行。

使用R語言包“DESeq”進行兩個條件/組的差異表達分析（每個條件兩個生物學重復）。DESeq提供統計程序，用于使用基于負二項分布的模型確定數字基因表達數據中的差異表達。使用參考文獻[14]的方法調整所得的P值以控制錯誤發現率。由DESeq發現的調整所得P值小于0.05的基因被指定為差異表達[14-15]。

根據白蓮藕轉錄組的測序結果和參考文獻[16]，獲得適用于白蓮藕物種的內參基因Actin的基因序列以及參與揮發性組分代謝途徑的相關基因的序列。然后根據已知的基因序列，利用Primer 3.0軟件設計各個基因的上下游引物（表2），引物委托相關公司合成。

1.3.3.7 差異基因的熒光定量PCR分析

取2 μg白蓮藕RNA，根據反轉錄cDNA試劑盒的說明方法，利用PCR儀合成cDNA。

根據蓮藕轉錄組測序結果，選取6 個參與揮發性組分代謝途徑的差異基因進行表達分析，以內參基因Actin為對照組，反應體系為：10 μL QpcrMix酶、10 μmol/L 0.8 μL引物F、10 μmol/L 0.8 μL引物R、0.4 μL染色劑2、2 μL cDNA、6 μL ddH2O。熒光定量PCR程序：95 ℃保持1 min；95 ℃保持10 s，60 ℃保持1 min，循環40 次。由熒光定量PCR儀分析得出結果。

1.4 數據處理

每組實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。數據使用JMP 10.0與SPSS 19.0統計軟件分析，采用獨立性t檢驗法分析顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 納米包裝對白蓮藕揮發性組分含量的影響

判別指數（discrimination index，DI）是電子鼻數據統計軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）時表征對所提供樣品的區分程度，DI在80～100之間表明區分有效，該值越大，區分效果越好，其值為PC1與PC2之和的整數部分[17]。圖1B顯示的判別指數為99，說明兩種包裝材料處理的白蓮藕可以用電子鼻區分開來。從圖1B中可以看出普通包裝和納米包裝的白蓮藕之間的間距較大，驗證了普通包裝和納米包裝的白蓮藕之間揮發性成分的差異。由表3可知，兩種包裝處理的白蓮藕的揮發性組分差異主要集中于醇類、烯烴類以及醛類物質。其中醇類方面的差異最為明顯，這也與電子鼻的數據結果相一致。其中抗菌包裝的白蓮藕未發現有劣變的氣味，并具有特異香味的物質，在普通包裝的白蓮藕中發現了烷烴類物質，并發現茴香醚這類蓮藕發酵產生的特殊物質，這說明白蓮藕經過普通包裝貯藏會產生發酵過程，影響白蓮藕的貯藏品質。

圖1 不同包裝處理的蓮藕風味雷達圖（A）及PCA圖（B）Fig. 1 Flavor radar chart (A) and principal component analysis plot (B)for lotus roots in different packaging treatments

表3 不同包裝處理的蓮藕揮發性組分Table 3 Volatile components of lotus roots in different packaging treatments

2.2 納米包裝材料對蓮藕MDA含量的影響

圖2 不同包裝處理對貯藏過程中蓮藕MDA含量的影響Fig. 2 Effect of different packaging treatments on MDA content in lotus roots

從圖2中可以看出，貯藏過程中，兩種包裝處理的白蓮藕體內MDA含量均呈現上升的趨勢。但普通包裝的白蓮藕體內MDA含量高于抗菌包裝的白蓮藕。在貯藏前期，抗菌包裝白蓮藕體內的MDA含量上升緩慢，而普通包裝的白蓮藕在整個貯藏期間都在迅速上升。當達到貯藏終點時，普通包裝袋內的白蓮藕MDA含量為1.021 7 mmol/g，而抗菌包裝的白蓮藕僅為0.865 4 mmol/g。當抗菌包裝的白蓮藕貯藏到第16天時，MDA的積累使得膜質過氧化程度加深，引起了蓮藕品質的劣變，從而引起了MDA積累速率的加快；而普通包裝的白蓮藕在第4天時就發生這一現象。這也與杏[18]、柑橘[19]、桃[20]果實在抗逆境條件下的結果相一致。

2.3 納米包裝材料對蓮藕總酚含量的影響

圖3 不同包裝處理對貯藏過程中蓮藕總酚含量的影響Fig. 3 Effect of different packaging treatments on total phenol content of lotus roots

從圖3可以看出，兩種包裝處理的白蓮藕體內的總酚含量在貯藏過程中均呈現下降的趨勢。普通包裝中白蓮藕的總酚含量迅速下降，在貯藏過程中抗菌包裝袋的白蓮藕總酚含量高于普通包裝白蓮藕。當達到貯藏終點時，抗菌包裝袋內的白蓮藕總酚含量為5.87 mg/100 g，而普通包裝白蓮藕貯藏終點時的總酚含量僅為4.64 mg/100 g。總酚含量與植物的抗氧化性能呈現正相關，隨著貯藏時間的延長，果實抗氧化性能下降，抗逆境能力也出現了下降，這與MDA含量的結果相一致。

2.4 納米包裝材料對蓮藕SOD、CAT活力的影響

圖4 不同包裝處理對貯藏過程中蓮藕SOD（A）、CAT（B）活力的影響Fig. 4 Effect of different packaging treatments on SOD (A) and CAT (B) activity of lotus roots

由圖4A、B可以看出，在貯藏期間蓮藕體內的SOD、CAT活力均呈先上升后下降的趨勢。采用納米抗菌包裝處理的白蓮藕有較高的SOD和CAT活力。在貯藏第4天，SOD和CAT活力均達到最高值，之后開始逐漸下降。SOD與CAT通過協同作用來有效清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）、提高生物抗氧化能力以適應環境的脅迫，當白蓮藕貯藏到第4天時，由于蓮藕自身品質的下降，對環境脅迫的適應能力也開始下降，引起酶活力的下降，但抗菌包裝的白蓮藕可以保持較高的SOD與CAT活力以適應環境的脅迫。

2.5 納米包裝材料對蓮藕揮發性組分代謝相關基因的影響

圖5為參與揮發性組分代謝過程的6 個基因的相對表達量，可以看出抗菌包裝材料包裝的蓮藕在基因表達量上有顯著的差異。其中104608054、104611134是參與抗氧化途徑的基因，可以表示蓮藕機體的抗氧化能力，這兩條基因在抗菌包裝的蓮藕體內均表現為上調，即與白蓮藕較強的抗氧化能力相關。104601200、104602034、104612735、104595789基因參與揮發性組分代謝過程，這4 個基因在抗菌包裝的白蓮藕體內均表現為下調，即與蓮藕較好的風味品質相關。

圖5 不同包裝材料對蓮藕揮發性組分相關基因表達量的影響Fig. 5 Effect of different packaging materials on the expression of genes related to volatile components in lotus roots

3 討 論

蓮藕的新鮮程度可以通過電子鼻判別出來，通過GC-MS對不同包裝蓮藕的揮發性組分分析，發現普通包裝的白蓮藕會有異常的風味物質產生，特別是蓮藕發酵的產物之一——茴香醚，這說明采用普通包裝的白蓮藕貯藏期間有發酵現象的產生；而抗菌包裝的白蓮藕中并沒有發現異常的風味物質產生，可以保持白蓮藕的風味品質。與普通包裝相比，納米抗菌包裝材料可以提高白蓮藕SOD、CAT活力及總酚含量，從而提高白蓮藕的抗氧化能力，最終提高白蓮藕的風味品質。

許多有關逆境脅迫對植物傷害的研究結果表明，ROS介導了膜脂的過氧化作用[21-22]。ROS（包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫和過氧化物自由基等）在細胞內大量積累時才會直接引起細胞膜脂的過氧化。MDA作為脂膜過氧化作用的終產物，其含量與細胞膜受損害程度密切相關，MDA的過量積累導致細胞膜受損進而導致電解質外滲，嚴重時甚至可導致細胞死亡。植物具有完善的ROS清除機制（包括酶和非酶抗氧化劑），以去除或限制細胞ROS水平的提升，從而適應生物和非生物脅迫因子的形式受到各種環境脅迫[23-25]。本研究表明納米抗菌包裝可能通過清除自由基，防止過剩的ROS攻擊體內大分子和生物膜，抑制膜脂過氧化作用，抑制白蓮藕體內MDA的積累，保持細胞的完整性從而保持白蓮藕的抗逆境能力，最終保持白蓮藕的風味品質。

正常情況下，植物體內的ROS可被細胞內的抗氧化系統清除；而當植物處于逆境脅迫時，抗氧化酶的活性受到影響，致使ROS積累，對膜造成傷害。SOD是植物體內清除ROS物質的重要酶，可清除超氧陰離子自由基，被譽為植物抵御逆境傷害的第一道防線，其活力是衡量植物抗逆性的重要指標[26]。SOD活力的下降與植物體的衰老呈正相關。CAT能有效抑制植物葉片中過氧化氫對細胞的氧化作用，因此，植物葉片中存在CAT是其保護自身免受羥自由基毒害的關鍵。SOD、CAT活力在貯藏期間表現出先升高后下降的趨勢，這可能由于在環境脅迫下，納米包裝材料中的納米銀離子可誘導產生SOD及CAT，使葉片中SOD、CAT活力增強；當環境脅迫超過了其自身的耐受程度時，SOD、CAT合成能力下降，從而導致SOD、CAT活力下降。本研究表明納米抗菌包裝可以提高SOD和CAT活力，并通過SOD和CAT的協同作用來清除白蓮藕體內的ROS，減少ROS在體內的積累，保持蓮藕貯藏期間的風味品質。

植物酚類化合物中酚羥基結構對ROS等自由基具有很強的清除能力，是構成植物抗氧化功效的重要功能性成分；但是，受其穩定性的影響，多酚類物質在貯藏過程中發生氧化、聚合或者分解，從而表現為酚類物質含量的下降[27]。本研究表明納米抗菌包裝可以延緩酚類物質含量的下降，保持白蓮藕的抗氧化能力、貯藏品質及風味品質。

植物激素和環境因子脅迫均能夠誘導巴西橡膠HbMT2a基因的表達[22]。本研究中，納米抗菌材料可以上調白蓮藕抗氧化通路上的基因表達以及抑制揮發性組分代謝通路上基因的表達，從而抑制了白蓮藕在貯藏期間風味品質的劣變。

4 結 論

采用抗菌包裝處理白蓮藕可以抑制MDA在白蓮藕體內的積累，延緩總酚含量的下降，減緩蓮藕機體的衰老，保持白蓮藕貯藏期間的食用品質。納米抗菌包裝調節了參與抗氧化以及揮發性組分代謝途徑的基因的表達，從而抑制不良風味的產生，保持白蓮藕的貯藏品質。

納米包裝可以很好地解決白蓮藕貯藏過程中食品安全性[28]以及貯藏效果一般等問題。雖然納米抗菌包裝可以保持白蓮藕抗氧化能力，但其機理尚不清楚，如何調控白蓮藕貯藏過程中新陳代謝中一些酶蛋白的轉錄和表達，定向控制白蓮藕的貯藏保鮮品質，是下一步研究的一個突破點。