生產類群、性別及包裝方式對冷藏牦牛肉肌漿蛋白氧化的影響

李思寧，唐善虎*

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

在肉品的加工貯藏過程中，脂肪和蛋白質氧化是導致肉品質劣變的一個重要原因[1]。由于蛋白質在細胞成分中含量高并能與活性氧高速反應，因此蛋白質是發生氧化的主要成分[2]。肌肉中的蛋白質可以通過活性氧直接修飾，也可通過脂肪氧化產物或HClO、H2O2等非自由基修飾。蛋白氧化會導致分子結構和完整性發生顯著變化，改變氨基酸側鏈性質、生成羰基衍生物、產生蛋白質聚合物等[3-4]，由此影響肉制品加工的營養和感官特性[5-8]。

牦牛是生存在高海拔地區的唯一牛種，由于長期的封閉繁衍和對環境生態的適應性，不同生產區域牦牛的生產性能和肉質出現了差異，形成了不同生產類群，但還不足構成具有顯著外貌和生產性能差異的品系。牦牛肉的肌漿蛋白約占牦牛肉總蛋白質量的30%～35%，大部分生化代謝及氧化還原反應都在肌漿蛋白中發生，與糖酵解相關的酶、與肉色有密切關系的肌紅蛋白也都存在于肌漿蛋白質內[10-11]。肌紅蛋白和參與代謝的酶類的氧化，會進一步導致肉顏色及肉質的劣變[12]。

現階段，有關肉類蛋白質的氧化研究主要集中在肉中肌原纖維蛋白在氧化劑或模擬氧化體系[13-14]、不同包裝[15-17]、不同加工處理[18-20]條件下結構和功能性的變化；而有關肌漿蛋白氧化對肉類功能特性方面的影響研究報道較少。馬紀兵等[21]研究了冷藏過程中非真空和真空包裝牦牛肉蛋白質條帶的變化情況，發現隨著冷藏時間的延長，這兩種包裝方式的牦牛肉肌漿蛋白表現出不同程度的降解。Sher[22]研究了反復凍融對雞胸肉品質的影響，發現凍融次數的增加導致蛋白氧化加劇，表現為羰基含量升高，巰基含量降低，肌漿蛋白降解。Marcos等[23]研究發現200 MPa以上的壓力會誘導肌漿蛋白溶解度和持水力降低、色澤改變及肌漿蛋白組成變化。Tokur等[18]發現在4 ℃冷藏條件下，2 歲齡細唇鯔魚肌漿蛋白羰基含量下降，4 歲齡和6 歲齡的羰基含量無顯著變化；肌漿蛋白條帶的變化與細唇鯔魚的年齡及β-巰基乙醇是否存在有關，主要表現在100、50 kDa及37 kDa附近蛋白條帶的改變。目前鮮見有關牦牛生產類群和性別影響牦牛肉低溫冷藏過程肌漿蛋白氧化特性的研究報道。本研究選取四川甘孜州4 個不同生產類群的公、母牦牛的背長肌，經普通包裝或真空包裝處理后，在4 ℃下冷藏，通過測定不同冷藏時間下肌漿蛋白質氧化、紫外吸收光譜及電泳指標，探討牦牛肉中肌漿蛋白質的氧化穩定性及蛋白質降解情況，為冷藏牦牛肉品質的控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取自然放牧狀態下，甘孜州色達、新龍、稻城及理塘4 個生產類群的健康無病的3 歲齡公牦牛各3 頭、母牦牛各3 頭，共計24 頭牦牛集中屠宰，采集背長肌，裝入潔凈保鮮袋中密封，放入-18 ℃冰箱急凍2 h，在4 ℃條件下運回實驗室。

乙二胺四乙酸、2,4-二硝基苯肼、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、硫氰化鉀、溴酚藍、β-巰基乙醇、尿素（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、過硫酸銨、甘氨酸、考馬斯亮藍R-250、標準牛血清白蛋白（均為分析純） 美國Sigma公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）標準蛋白（11～245 kDa） 上海生化試劑公司。

1.2 儀器與設備

5804離心機 德國Eppendorf公司；紫外-可見分光光度計 上海翱藝公司；FSH-2A高速組織勻漿機 金壇市華城海龍實驗儀器廠；HH-6恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；Mini電泳槽、Versa Doc 1000凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

甘孜州色達（SD）、新龍（XL）、稻城（DC）及理塘（LT）4 個不同生產類群的公（male，M）、母（female，F）牦牛肉切割成厚度1 cm、每份質量50 g的肉塊，經過普通包裝（2絲聚乙烯復合包裝膜）或真空包裝（10 cm×20 cm的雙面20絲聚乙烯復合真空包裝袋）處理后，在4 ℃條件下冷藏。從第0天開始，每隔3 d取一次樣，肉樣變質（色澤及氣味改變）作為取樣的終點。所有樣品提取肌漿蛋白后，測定蛋白氧化指標、紫外吸收光譜及SDS-PAGE。

1.3.2 肌漿蛋白的提取及測定

參考Tokur等[18]的方法，并略作修改。取牦牛肉5 g，剔除脂肪和結締組織，切成2 mm×2 mm×2 mm大小的肉粒，添加5 倍體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），13 000 r/min勻漿60 s，5 000 ×g、4 ℃離心20 min，上清液經4號濾紙過濾，沉淀再加提取液提取，重復上述操作，合并兩次離心的上清液，即為肌漿蛋白。采用雙縮脲法測定蛋白含量[24]。

1.3.3 羰基含量的測定

羰基含量的測定采用Levine等[25]的方法，并略作修改。1 mL 5 mg/mL的蛋白溶液與1 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼（用2 mol/L鹽酸溶解）混勻，以2 mol/L鹽酸溶液作對照；將反應體系置于黑暗中反應1 h，每隔10 min漩渦1 次；反應完畢后，加入1 mL、質量分數20%的三氯乙酸溶液，搖勻后12 000 ×g、4 ℃離心15 min，棄上清液；沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯混合物（1∶1，V/V）洗滌3 次，再溶于3 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液（37 ℃水浴15 min）；12 000 ×g離心15 min除去不溶物質，取上清液，在波長370 nm波長處測定吸光度（A）。羰基含量按公式（1）計算。

式中：ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）；D為比色光徑（1 cm）；22 000為摩爾吸光系數/（L/（mol·cm））；3為稀釋倍數。

1.3.4 總巰基含量的測定

梁誠趁著夜色離開家，來到一間公寓，拿鑰匙開門。一個女人坐在沙發上看著電視吃著薯片。看見開門的梁誠，女人開心地叫了一聲：“老公，你來啦！”

總巰基的測定參考Ellman[26]的方法。取1.5 mL 5 mg/mL蛋白溶液與10.0 mL Tris-甘氨酸緩沖液（含8 mol/L尿素、0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0）混勻；將以上處理樣品分別加50 μL 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（用0.1 mol/L的Tris-鹽酸溶解，pH 7.6）試劑，劇烈振蕩后在25 ℃條件下水浴1 h，12 000 ×g離心10 min，同時以0.1 mol/L Tris-鹽酸作為對照，取上清液在412 nm波長處測定吸光度（A）。蛋白中巰基含量用公式（2）計算。

式中：ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）；13 600為摩爾吸光系數/（L/（mol·cm））；D為比色光徑（1 cm）；7.67為稀釋倍數。

1.3.5 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定參考Chelh等[27]的方法。取1 mL 5 mg/mL蛋白溶液，加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液，振蕩混勻10 min，7 000×g離心15 min，上清液稀釋10 倍后，在595 nm波長處測定吸光度（A）。空白樣為未加樣品的磷酸鹽緩沖液。以溴酚藍結合量表示表面疏水性，按公式（3）計算。

1.3.6 紫外吸收光譜測定

將肌漿蛋白稀釋到0.4 mg/L，在200～300 nm波長處進行紫外掃描，記錄吸收光譜。

1.3.7 牦牛肉肌漿蛋白SDS-PAGE

牦牛肉肌漿蛋白的SDS-PAGE參考Laemmli[28]的方法。1 mg/mL待測蛋白質和5×樣品緩沖液以體積比3∶1混合，沸水浴5 min，冷卻后上樣，上樣體積為10 μL。分離膠質量分數12%、濃縮膠質量分數4%。電泳后用質量分數為0.2%的考馬斯亮藍R-250染色液染色，用含體積分數7.5%甲醇和7.5%醋酸的脫色液脫色至背景清晰。使用凝膠成像儀拍照，分析蛋白聚集與降解變化。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 冷藏過程中牦牛肉肌漿蛋白羰基含量的變化

羰基的產生作為蛋白氧化的標志之一，是由易受自由基攻擊的帶有—NH—或者—NH2的氨基酸殘基以及肽鍵的斷裂生成。

由表1可知，普通包裝組肌漿蛋白羰基在冷藏前3 d迅速增加，第3天顯著高于第0天的羰基含量（P＜0.05）；至第6天，羰基含量顯著下降（P＜0.05）；冷藏第9天，羰基含量達到最大值。肉類產品在低溫保藏過程中，羰基含量會上升[29-30]，但是隨冷藏時間的延長，羰基含量可能會下降，如通過Strecker反應降解[31]。有研究報道，新生成的羰基會攻擊蛋白質中的親核物質，發生羰氨縮合反應，導致羰基含量降低[32]。在普通包裝組中，生產類群之間肌漿蛋白羰基含量差異顯著（P＜0.05）；同一生產類群的公、母牦牛肉之間肌漿蛋白羰基含量差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 不同冷藏時間的牦牛肉肌漿蛋白羰基含量Table 1 Carbonyl contents of sarcoplasmic proteins in yak meat at different storage times

冷藏0～9 d，真空包裝組肌漿蛋白羰基含量顯著增加（P＜0.05）；除SD-M和LT-M組外，其余組在第3、6天羰基含量差異不顯著（P＞0.05）。第12天，羰基含量下降，表明羰基可能發生了降解或聚合或被進一步氧化成了其他的產物；至第15天時，羰基含量又增加；除SD-M和LT-F外，其余組羰基含量在第15天均與第9天無顯著差異（P＞0.05），說明蛋白氧化加劇。在真空包裝組中，生產類群之間肌漿蛋白羰基含量差異顯著（P＜0.05）；同一生產類群的公、母牦牛肉之間肌漿蛋白羰基含量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 冷藏過程牦牛肉肌漿蛋白總巰基含量的變化

半胱氨酸殘基是蛋白質中最容易受到攻擊的氨基酸殘基，總巰基含量可以用來評價半胱氨酸殘基的氧化狀態。肌肉蛋白中的巰基基團發生氧化，生成二硫鍵、次磺酸、亞磺酸和磺酸[33]。Eaton[34]研究發現，在不同的氧化環境下，蛋白質巰基可以被可逆地氧化為二硫鍵和次磺酸（早期氧化過程），也可以被不可逆地氧化為亞磺酸和磺酸。

由表2可知，隨冷藏時間的延長，普通包裝組肌漿蛋白總巰基含量在0～3 d無顯著變化（P＞0.05），說明冷藏前期，包裝袋內的活性氧使部分巰基被可逆地氧化成了二硫鍵和次磺酸；3 d后，總巰基含量顯著下降（P＜0.05），在此階段巰基被氧化的速度大于被還原的速度，生成了不可逆的氧化狀態，形成了非二硫鍵的含硫化合物。在普通包裝組中，生產類群之間肌漿蛋白總巰基含量差異顯著（P＜0.05）。同一生產類群的公、母牦牛肉之間肌漿蛋白總巰基含量差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同冷藏時間的牦牛肉肌漿蛋白總巰基含量Table 2 Sulfhydryl contents of sarcoplasmic proteins in yak meat at different storage times

冷藏0～6 d，真空包裝組肌漿蛋白總巰基含量下降（P＜0.05），包裝內殘留的氧使暴露在蛋白質表面的半胱氨酸發生了氧化，導致巰基含量減少。6～15 d，總巰基含量基本趨于穩定（P＞0.05），可能是包裝內的氧分壓較低，巰基被氧化速度約等于被還原的速度，表現出巰基含量沒有發生大的改變。在真空包裝組中，生產類群之間肌漿蛋白總巰基差異顯著（P＜0.05）；同一生產類群的公、母牦牛肉之間肌漿蛋白總巰基含量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 冷藏過程牦牛肉肌漿蛋白表面疏水性的變化

表面疏水性反映的是蛋白質表面疏水性氨基酸的相對含量，疏水性的改變與蛋白質結構變化密切相關。

表3 不同冷藏時間的牦牛肉肌漿蛋白表面疏水性Table 3 Surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins in yak meat at different storage times

由表3可知，隨冷藏時間延長，普通包裝組肌漿蛋白疏水性呈上升趨勢。氧化引起肌漿蛋白構象改變后，肌漿蛋白中更多的疏水性氨基酸殘基暴露，導致表面疏水性增加。與第6天相比，第9天肌漿蛋白表面疏水性沒有顯著增加，可能是隨著氧化繼續進行，蛋白表面的疏水基團由于疏水相互作用發生了聚集[35]。在普通包裝組中，生產類群之間肌漿蛋白疏水性差異顯著（P＜0.05）；同一生產類群的公、母牦牛肉之間肌漿蛋白疏水性差異均不顯著（P＞0.05）。

真空包裝組肌漿蛋白疏水性在0～6 d呈增加的趨勢，隨后疏水性開始下降。6 d后肌漿蛋白表面疏水性開始緩慢下降，可能是由于暴露的疏水性氨基酸殘基發生聚集或形成了其他疏水性物質。在真空包裝組中，生產類群之間肌漿蛋白疏水性差異顯著（P＜0.05）。同一生產類群的公、母牦牛肉之間肌漿蛋白疏水性差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 冷藏過程牦牛肉肌漿蛋白紫外吸收光譜

二階導數紫外分光光度法是一種用于測定幾種化合物定性和定量的分析方法，如鑒別氨基酸、揭示蛋白質結構的變化[36]。

由圖1A可知，冷藏第0天，普通包裝組肌漿蛋白在245 nm及285 nm波長處各有1 個波峰，在235、280 nm及290 nm波長處各有1 個波谷；280 nm和290 nm波長處的吸收峰分別歸屬于酪氨酸和色氨酸殘基，285 nm波長處的波峰歸屬于色氨酸和酪氨酸的共同作用[37]。由圖1B可知，與第0 天相比，第3天的二階導數紫外光譜在280～290 nm波長處的吸收峰均減弱，這可能是酪氨酸、色氨酸被氧化后含量降低造成的；245 nm波長處明顯的吸收峰表明肌漿蛋白中K帶的存在，即存在共軛的不飽和鍵。由圖1C、D可知，在第6、9天，樣品均在295 nm波長處有明顯的正吸收，其余波段有很低強度的紫外吸收，第9天的吸收峰強度大于第6天的。在整個冷藏過程中，肌漿蛋白構象發生了很大程度的變化，尤其在冷藏第3天改變最明顯。在氧自由基的攻擊下，芳香族氨基酸、帶有—NH—或者—NH2的氨基酸被氧化及疏水性氨基酸暴露都會導致肌漿蛋白構象發生變化。而相同冷藏時間，普通包裝組的不同生產類群及性別的牦牛肉肌漿蛋白紫外吸收譜圖波形一致。

圖1 不同冷藏時間的普通包裝組肌漿蛋白紫外二階導數紫外光譜圖Fig. 1 Second-order derivative UV spectra of sarcoplasmic proteins in air-packaged yak meat at different storage times

圖2 不同冷藏時間的真空包裝組肌漿蛋白紫外二階導數紫外光譜圖Fig. 2 Second-order derivative UV spectra of sarcoplasmic protein in vacuum-packaged yak meat at different storage times

與第0天相比，第3天的二階導數紫外光譜在280～290 nm波長處的吸收峰均減弱（圖2A、B）。由圖2B可知，真空包裝組肌漿蛋白在貯藏第3天的紫外波譜與普通包裝組第3天相似，區別在于245 nm處的波谷紅移到了255 nm。由圖2C～E可知，冷藏第6、9、12天的波譜與普通包裝組第6天基本一致。由圖2F可知，與第12天相比，第15天肌漿蛋白的波譜發生了改變，295 nm處的波峰藍移到了290 nm處，且吸收峰明顯增強，表明蛋白質氧化程度加劇。所處的微環境疏水時，特征譜峰會發生藍移[38]。冷藏6～12 d，肌漿蛋白的紫外吸收譜圖無明顯改變，說明真空包裝抑制了蛋白質氧化。在整個冷藏過程中，肌漿蛋白構象在冷藏第3天變化最明顯。相同冷藏時間，真空包裝組的不同生產類群及性別的牦牛肉肌漿蛋白紫外吸收譜圖波形一致。

2.5 冷藏過程牦牛肉肌漿蛋白SDS-PAGE

圖3 不同冷藏時間的普通包裝組肌漿蛋白SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE patterns of sarcoplasmic proteins in air-packaged yak meat at different storage times

由圖3A～D可知，隨冷藏時間的延長，普通包裝組的牦牛肉肌漿蛋白分子質量逐漸降低，所有蛋白條帶都發生了一定程度的弱化。冷藏第0天，245 kDa附近的蛋白條帶是區別于其他冷藏時間的明顯條帶。第3天，245 kDa附近的蛋白條帶消失，降解成了20～75 kDa及135～180 kDa的小分子蛋白質。第6天和第9天電泳圖中100～135 kDa的蛋白條帶明顯弱化或消失，其他條帶也發生了弱化；在第9天，35～48 kDa的條帶基本消失。在整個冷藏過程中，100 kDa附近的兩條條帶一直存在，可能為糖原磷酸化酶（97 kDa）和β-半乳糖苷酶（116 kDa）[39-40]。肌紅蛋白（17 kDa附近）在冷藏0～3 d時存在，第3天時條帶已發生弱化，6 d后全部消失。Grune等[41]發現氧化的增加可以通過蛋白酶促進蛋白質降解。Ryu等[42]發現肌漿蛋白條帶的弱化伴隨著析出的肌漿蛋白結合到肌原纖維蛋白上，因此肉色由紅色轉變為蒼白色。相同冷藏時間，普通包裝組的不同生產類群及性別的牦牛肉肌漿蛋白SDS-PAGE圖譜中蛋白條帶一致。

由圖4A～F可知，隨冷藏時間的延長，真空包裝組牦牛肉的肌漿蛋白分子質量降低，所有蛋白條帶都發生了一定程度的弱化。與第0天相比，冷藏第3天真空包裝組的肌漿蛋白245 kDa附近的蛋白條帶消失，電泳圖譜與相同冷藏時間的普通包裝組一致。冷藏第6天，肌漿蛋白電泳圖中100～135 kDa的蛋白條帶消失，降解成了分子質量在20 kDa附近的小分子蛋白質，且63 kDa附近的條帶發生了弱化。第9、12、15天的肌漿蛋白電泳圖基本一致，與其他時間的圖譜相比，所有條帶均發生了弱化。相同冷藏時間，真空包裝組的不同生產類群及性別的牦牛肉肌漿蛋白電泳圖譜中蛋白條帶一致。本實驗牦牛肉的肌漿蛋白條帶的分布規律和分子質量與馬紀兵等[21]報道的甘南牦牛肉有較大差異，這可能是牦牛品種差異造成的。

3 結 論

在整個冷藏過程中，采用普通包裝或真空包裝的4 個生產類群的公、母牦牛肉肌漿蛋白的氧化程度均增加，具體表現為：隨冷藏時間的延長，2 種包裝的羰基含量均呈波浪式上升，總巰基含量下降；普通包裝表面疏水性顯著增加（P＜0.05），真空包裝表面疏水性在0～6 d增加，隨后降低；紫外吸收光譜改變，冷藏第3天光譜改變最為明顯；245 kDa附近及100～135 kDa蛋白條帶消失或弱化。相同包裝方式的公、母牦牛肉之間肌漿蛋白羰基、總巰基含量和表面疏水性差異不顯著（P＞0.05）。相對于普通含氧包裝，真空包裝可以有效抑制肌漿蛋白氧化，并且有效延緩蛋白的氧化速率。對于相同包裝組，不同生產類群之間肌漿蛋白的氧化程度差異顯著（P＜0.05），表明不同生產類群牦牛的生產性能和肉質確實出現了差異；但肌漿蛋白氧化與牦牛的性別無關（P＞0.05）。

綜上所述，牦牛肉在低溫貯藏及加工過程中，應從包裝方式及牦牛的生產性能方面著手采取措施，以便有效抑制蛋白質的氧化，減少肉質在顏色、食用品質方面的劣變。