食品功能成分對氧化三甲胺介導的動脈粥樣硬化的影響研究進展

郭靖婷，焦 睿*，蔣鑫煒，李 夏，李旭升，冉國敬，白衛濱

（暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是當今社會危害人類健康、導致人類死亡最主要的疾病之一。《2016年中國心血管病報告》表明，CVD死亡率目前仍居我國疾病死亡構成的首位，高于腫瘤和其他疾病，占居民疾病死亡構成的40%以上[1]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CVD的主要病理基礎[2]，其發展受多種因素共同調節。動脈壁內皮細胞的受損會促使血循環中的單核細胞黏附到血管內皮表面，并從單核細胞分化為巨噬細胞。巨噬細胞通過吞噬內皮下層的氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）進一步發展為泡沫細胞，并在內皮下層脂質堆積，形成AS斑塊[3-5]。此外，平滑肌細胞的增殖會導致覆蓋脂質核心的炎性纖維組織應激增生，形成粥樣斑塊，造成動脈壁變厚及失去彈性[6]，動脈管腔狹窄閉塞進而引起梗塞[7]。從傳統上來看，內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞是構成AS病灶的三要素，它們相互作用，促進AS發展[7]。人們的日常膳食結構、生活方式、環境和遺傳等因素都對AS的發生、發展過程存在一定影響。隨著人們物質生活水平的提高，大眾對于飲食影響AS這一方面的關注度逐漸提升。

研究表明，肉、蛋、海鮮類食物中含量豐富的三甲胺（trimethylamine，TMA）類結構營養素如膽堿、L-肉堿等，在腸道菌群作用下最終可生成氧化三甲胺（trimethylamine-N-oxide，TMAO），且雜食者相較于素食者可產生更多TMAO[8]。人群實驗表明，血清中TMAO水平的升高會使頸動脈內膜中層厚度增加，且獨立于已有的CVD危險因素[9]。TMAO能從抑制膽汁酸合成轉運和促進泡沫細胞形成兩方面造成膽固醇在體內的堆積，促進AS的發生發展[10-12]、血小板聚集[13]以及糖尿病和高血壓的形成[14]。然而，膽堿作為人體必需營養素，具有抗炎、調節免疫功能[15]、改善脂質代謝[16]、促進腦發育[17]等有益功能，在日常生理功能和疾病預防中都發揮著重要作用，因此膽堿的攝入無法被完全避免。而通過抑制TMAO的生成代謝，減小AS風險，可開啟CVD防治的一個新方向。

1 TMAO形成過程

膳食膽堿、磷脂酰膽堿、肉堿在人體中主要經過兩個階段最終形成TMAO。第1階段為膳食膽堿等通過腸道菌群TMA裂解酶作用，裂解C—N鍵，形成TMA。第2階段為TMA通過門脈循環進入肝臟，并在黃素單加氧酶3（flavin-containing monooxygenase 3，FMO3）作用下迅速氧化形成TMAO。

2 TMAO促進AS的作用途徑

2.1 抑制膽汁酸合成和轉運

TMAO能通過降低膽汁酸合成主要酶如膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxy-lase，CYP7A1）、膽固醇27α-羥化酶（cholesterol 27α-hydroxy-lase，CYP27A1）和膽汁酸轉運蛋白（Oatp1、Oatp4、CFTR/MRP、Mrp2、Ntcp）表達，抑制膽汁酸合成和轉運[18]。膽汁酸是膽固醇代謝的主要去路，人體內約有50%的膽固醇會在肝臟中被代謝為膽汁酸，最終通過糞便排出體外或經腸肝循環重吸收回肝臟[19]。而膽汁酸的合成途徑主要有兩條：一條為經典途徑，也是合成膽汁酸的主要通路，該通路的限速酶為CYP7A1，CYP7A1能催化膽固醇合成7α-羥化膽固醇，經一系列酶促反應生成膽汁酸，并通過擴大膽汁酸池增加膽固醇轉運；另一條為替代途徑（約占人體總膽汁酸合成的25%），在經典途徑受阻時可被激活，其限速酶為CYP27A1，它不僅能影響膽汁酸的生物合成，還能催化膽固醇合成27-羥基膽固醇直接流入肝臟代謝成膽汁酸[20-23]。CYP7A1和CYP27A1表達的降低會抑制膽汁酸合成，同時干擾血循環中的膽固醇逆向轉運（reverse cholesterol transport，RCT）[8,12,24]，造成膽固醇在細胞內的堆積，進而導致AS，造成CVD發病率的上升[10,25]。

2.2 促進泡沫細胞形成

膽固醇會在巨噬細胞中聚集并使巨噬細胞泡沫化，形成泡沫細胞，其在AS進程中發揮著重要作用[26]。TMAO能通過促進巨噬細胞A1型清道夫受體（scavenger receptor A1，SR-A1）和B類清道夫受體36（cluster of differentiation 36，CD36）的表達，參與泡沫細胞的形成[24]。CD36作為巨噬細胞表面起識別、內吞ox-LDL作用的主要清道夫受體[27]，能刺激巨噬細胞與ox-LDL結合，使膽固醇在巨噬細胞中聚集[28]，導致巨噬細胞泡沫化。最新研究發現，單獨使用TMAO可以增加ox-LDL誘導的CD36表達[29]。SR-A1能與ox-LDL特異性結合，導致巨噬細胞內的膽固醇堆積[30]。當巨噬細胞無法清除自身過量的膽固醇時，則會由巨噬細胞進一步發展為泡沫細胞，這也是泡沫細胞形成的主要機制[31-32]。ox-LDL在泡沫細胞中大量堆積使細胞脹破死亡后，會形成富含膽固醇的脂質核心，并在內皮細胞等作用下形成AS斑塊[33]；另一方面，TMAO能干擾RCT，促進泡沫細胞形成[24]。RCT是指將肝外組織細胞內的膽固醇經脂蛋白運輸到肝臟，以膽汁形式分泌，最終通過糞便排出體外的膽固醇代謝過程，也是機體排出過多膽固醇的唯一途徑[34-35]。TMAO可能通過抑制RCT，使膽固醇在巨噬細胞內不斷積累，形成泡沫細胞，進而產生AS斑塊[24-25]。細胞實驗發現，TMAO還能通過絲裂原活化蛋白激酶和核因子-κB信號通路促進血管炎癥[36]，激活細胞間黏附分子ICAM-1，加速泡沫細胞形成和AS發展進程[29,37]，但此結果還需進一步實驗證實。ICAM-1為免疫球蛋白超家族成員，正常情況下ICAM-1不表達或很少表達，但在AS形成過程中，動脈內皮的損傷會引起內皮細胞表面黏附性的改變，并促進單核細胞黏附、遷移至內皮下層，轉化為巨噬細胞，攝取脂質形成泡沫細胞[38]。

因此，可以通過調節腸道菌群抑制TMA生成和FMO3活性以減少TMAO產生，促進膽汁酸合成轉運，抑制TMAO參與泡沫細胞形成，從而達到抗AS的目的（圖1）。

圖1 TMAO形成及其促進AS作用途徑Fig. 1 Effect of TMAO production on AS

3 食品功能成分調節TMAO對AS的影響及作用機制

機體內的TMAO水平很大程度上影響著AS的發病率，而食品功能成分干預正是通過不同的途徑調節體內TMAO水平，從而抑制AS的發生、降低發病風險。

3.1 重塑腸道菌群構成比例，減少TMA產生

腸道菌群能將膳食膽堿、肉堿等轉化為TMAO的前體物質TMA。腸道菌群組成的差異與肥胖和糖尿病等慢性代謝疾病以微妙的方式相互關聯[39-41]，且其還參與血小板功能調節，能增加血栓形成[42]。研究表明，腸道菌群的豐度與CVD的標志物有顯著相關性，其中豐度低的個體更易出現脂質代謝異常[43]。人群研究發現腸道菌群可能通過調節受試者體內脂質代謝來影響AS，且以擬桿菌、普雷沃氏菌、梭狀芽孢桿菌等為代表[44]。Liao Zhenlin等[45]發現茶葉中的活性物質茶多酚可促進腸道中雙歧桿菌生長從而抑制AS的發生。紅棗[46]、豆渣[47-48]等膳食纖維能通過在腸道中被微生物分解產生短鏈脂肪酸，降低腸道環境pH值，從而促進乳酸桿菌等益生菌的生長，抑制沙門氏菌等致病菌的生長，達到改善脂質代謝的目的[49]。近期研究顯示，改善腸道菌群調節脂質代謝可能與TMAO抑制有關[50]，但目前國內外有關于這方面的營養干預研究較少。

采用戶天然多酚類化合物白藜蘆醇（resveratrol，RSV）喂養C57BL/6J小鼠，發現小鼠腸道中擬桿菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌株相對豐度增加，普雷沃氏菌、幽門螺桿菌的相對豐度降低，并伴隨著血漿中TMA和TMAO水平顯著降低，肝臟膽汁酸合成增加。結果表明RSV可能通過重塑腸道中菌群的比例和構成，增強擬桿菌屬、乳桿菌屬、雙桿菌屬等有益菌株的相對比例，抑制TMAO的合成，達到抗AS效果[10]。動物研究采用抗生素處理小鼠，誘導小鼠體內腸道菌群失活，發現使用初期可抑制TMA生成，但長期使用單一抗生素（使用環丙沙星6 個月），則失去抑制TMA生成的作用，這一發現與耐抗生素微生物擴大現象一致[51]。大蒜中的有效成分大蒜素是一種具有抗菌療效的天然植物化合物[52]。給小鼠喂食飲食肉堿和大蒜素，結果表明肉堿造模組小鼠糞便微生物菌群中的羅賓遜菌比例（與TMAO水平呈正相關）高于對照組，且其血漿TMAO水平是對照組的4～22 倍。肉堿加大蒜素的干預組小鼠羅賓遜菌的比例處于對照組和造模組之間，但血漿TMAO水平與對照組相比沒有差異[53]。這項研究結果表明膳食大蒜素可能是通過與硫醇基團的快速反應抑制微生物中的某些含硫酶[54]，從而抑制肉堿飲食誘導的腸道菌群功能改變，降低TMAO水平。而到目前為止，尚鮮有報道腸道菌群中具體負責產生TMA的細菌種類，因此難以直接證明大蒜素對TMA生產者的抑制效果[53]。Hernández-Alonso[55]和Lamuel-Paventos[56]等在探索開心果有益功效的過程中發現，膽堿含量豐富的開心果卻能使血漿TMAO含量減少。推測這可能是因為開心果中富含以原花青素為主的聚合多酚，能在腸道中被腸道菌群代謝，增加雙歧桿菌和乳酸桿菌比例。喂食腸桿菌ZDY01能使小鼠血漿TMAO和盲腸TMA水平顯著降低，并且降低螺桿菌科等致病菌的相對比例。ZDY01可作為一種益生菌，通過直接抑制腸道中TMA的生成來重塑腸道菌群，從而減少TMAO含量[57]。

通過食品功能成分干預重塑腸道菌群的構成、比例和數量，影響TMAO前體物質的產生進而調節AS為目前研究的主要途徑。但同時用膽堿、肉堿等TMAO前體物質加功能成分干預的研究并不多，且多以動物實驗為主，仍需更多相關細胞實驗和人群實驗來支持。

3.2 抑制FMO3活性，降低TMAO水平

TMA進入肝臟轉化為TMAO需要FMOs參與調節[8]。而在FMO家族中FMO3的活性最高，小鼠中FMO3過表達會使血漿TMAO水平顯著升高，FMO3不表達則可降低TMAO水平[12]。Warrier等[58]給敲除FMO3基因小鼠喂食膽固醇，發現相較于未敲除小鼠，其膽汁的分泌減少，并伴隨著血漿中TMAO水平的下降。通過進一步研究發現，FMO3的活性與性別顯著相關，且小鼠中雌鼠比雄鼠FMO3表達量高。這主要是因為在雌鼠中，大多數TMAO是由肝臟FMO3產生的，但是在缺乏肝臟FMO3的雄鼠中，大部分TMAO的產生是FMO1在起作用[12]。

FMO3之前已被證明由性激素和膽汁酸共同調節，但FMO1受性別影響較小[12,59]。通過藥物來抑制FMO家族和特異性抑制FMO3的活性也被認為是一種可能減少TMAO合成、降低AS風險的潛在治療措施。然而，FMO3被抑制會使得TMA在體內蓄積過多，產生魚腥味氣體，使人產生三甲基氨尿癥等不良反應[60-61]，不利于身體健康，因此這項治療措施的可行性較低，其相關的營養干預研究也很少。

3.3 促進膽汁酸合成轉運，使膽固醇通過膽汁酸代謝轉出

TMAO能下調膽汁酸合成主要酶和膽汁酸轉運蛋白的表達，減少膽汁酸的分泌，引起膽汁酸池大小及組成成分改變，進而限制體內膽固醇分解代謝[10]。將TMAO飲食組小鼠的肝臟與普通飲食組小鼠相比，發現關鍵膽汁酸合成限速酶CYP7A1和CYP27A1表達顯著降低，且膽汁酸轉運蛋白Oatp1、Oatp4、CFTR/MRP、Mrp2、Ntcp表達也顯著下降。這表明TMAO可能通過抑制膽汁酸合成和轉運途徑從而干擾血循環中的RCT[8]。

RSV被證實能改善高脂喂養小鼠的高膽固醇血癥[62]。給C57BL/6J小鼠喂食RSV，發現相較于膽堿飲食組小鼠，RSV干預組小鼠血漿中TMA和TMAO水平與對照組相比顯著降低，且伴隨著CYP7A1表達的顯著上調和法尼酯X受體（farnesoid X receptor，FXR）、成纖維細胞生長因子15（fibroblast growth factor 15，FGF15）表達的下調[10]。FXR-FGF15軸與CYP7A1之間存在著負反饋調節，同時這也是維持膽汁酸穩態最重要的機制之一[63]。RSV可能通過上調CYP7A1表達以及下調FXR-FGF15軸反作用于CYP7A1，增加了膽汁酸的合成代謝[10]。通過實驗發現，促進膽汁酸代謝以增加膽固醇的排出可以減少脂質堆積，降低AS風險。

3.4 減少泡沫細胞形成，減少脂質堆積和減輕炎癥反應

TMAO可能通過促進巨噬細胞受體SR-A1、CD36表達上調和抑制RCT進程加速泡沫細胞形成[24-25]。通過對ApoE-/-小鼠分別進行膽堿、TMAO、甜菜堿飲食飼養，并以正常飲食小鼠作為對照，發現與對照組相比，膽堿、TMAO、甜菜堿處理都上調了小鼠CD36和SR-A1的表達水平。這表明TMAO及其前體物質膽堿和甜菜堿在增強巨噬細胞的膽固醇積聚和泡沫細胞形成中起著重要的作用，其可能通過上調CD36和SR-A1表達量，促使LDL氧化成ox-LDL來增強膽固醇的聚積和泡沫細胞的生成，從而導致炎癥的產生[24]。

M1和M2型巨噬細胞存在著相反的作用，M1型巨噬細胞具有促炎作用，而M2型巨噬細胞具有抗炎作用[64]。飲食中TMAO可能通過增加巨噬細胞M1的表達比例、減少巨噬細胞M2表達來加重脂肪組織炎癥[65]。已有研究證實，魚油能改善由TMAO加劇的脂肪組織炎癥[65]，并促進肥胖小鼠的脂肪組織巨噬細胞由M1表型轉為M2表型[66]。魚油可能通過下調有關巨噬細胞的表達，緩解或抑制TMAO產生的危害。而也有研究發現魚肉中存在促AS風險因子，Yazdekhasti等[67]在研究魚類蛋白保健功效時發現，分別喂食魚蛋白、酪蛋白、大豆蛋白飲食的ApoE-/-小鼠中，魚蛋白組ApoE-/-小鼠與酪蛋白及大豆蛋白組小鼠相比CD36得到明顯上調，這會使得AS斑塊顯著增大，加劇心血管損傷。該研究組分析，這可能是因為與酪蛋白和大豆蛋白相比，魚蛋白分離物中有更高含量的脂肪酸，尤其是飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸以及膽固醇。當機體無法完全排除過多的飽和脂肪酸以及殘留的膽固醇時，就會促使泡沫細胞的形成，增加AS風險。此外，攝入奶酪也可以降低TMAO的產量[68]，其機制可能是發酵乳制品尤其是奶酪會通過消化碳水化合物產生短鏈脂肪酸，降低腸道環境pH值，從而促進乳酸桿菌等有益菌群增加[69-70]，而且短鏈脂肪酸還能通過下調巨噬細胞清道夫受體CD36，減少巨噬細胞的黏附和遷移以及增加斑塊穩定性來改善病變[71]。葡萄和黑豆皮等果蔬中富含花色苷，流行病學研究顯示花色苷具有降低AS風險的功效[72-73]。劉素穩[74]通過研究發現，藍靛果花色苷提取物能使小鼠血漿TMAO水平下降，且能通過上調巨噬細胞中ATP結合盒轉運體A1和ATP結合盒轉運蛋白G5/G8（ATP-binding cassette transporter G5/G8，ABCG5/G8）的表達，加速小鼠巨噬細胞RCT進程，達到顯著抗AS作用。通過活體小鼠模型發現，抑制TMAO誘導的從巨噬細胞到泡沫細胞的形成過程，促進RCT以增加膽固醇的排出，可以減少脂質堆積、減輕炎癥，降低AS風險。

3.5 其他

研究表明，苦蕎麥可以預防CVD[75]。苦蕎麥黃酮可升高血漿中一氧化氮（nitric oxide，NO）和內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）濃度，降低TMAO喂養小鼠血漿中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇等含量，減少TMAO誘導的心血管功能障礙。推測其可能通過激活eNOS/NO通路，刺激NO和eNOS等合成來預防內皮功能障礙，降低AS風險[76]。動物實驗發現，麥麩可激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路，推測活化的腸上皮AMPK能對腸道菌群裂解酶產生抑制作用，減少TMA產生[77]。而人群研究通過給志愿者服用多菌株益生菌multi-strain probiotic VSL#3，發現其對TMAO血漿濃度無影響，其具體機制仍需進一步研究（表1）[78]。

表1 食品或功能成分調節TMAO對AS的影響Table 1 Bioactive compounds in foods alleviates atherosclerosis by regulating the formation of TMAO

4 結 語

研究發現膽堿、肉堿等代謝產物TMAO可能成為新的獨立的CVD危險因素。而膽堿作為人體必需營養素可對許多疾病有改善作用，因此通過干預TMAO形成過程來降低AS風險具有重要意義。食品功能成分可以通過抑制TMAO的生成途徑來降低AS風險。本文綜述了調節TMAO作用于AS的4 個方面：重塑腸道菌群構成比例；抑制肝臟中FMO3活性；促進膽汁酸合成轉運；減少泡沫細胞生活，為未來防治AS提供了新的思路和理論依據。綜合目前的研究進展，仍存在一些問題需進一步探討研究。腸道菌群中作用于膽堿、L-肉堿、磷脂酰膽堿，負責產生TMA的具體細菌種類沒有完全明確，研究仍處于表面階段，需要進一步探索論證。同時，TMAO影響AS的具體作用機理仍不十分明確，有待進一步探討。此外，目前該方向的研究多以動物實驗為主，以干擾腸道菌群途徑入手，相關人群實驗、體外模擬實驗以及進一步的分子機制研究相對缺乏，需要引起重視。綜上所述，通過干預TMAO這一途徑進一步了解膳食對CVD的干預具有重要意義。