不明原因的自發流產與精子DNA損失的關系

劉成軍 涂艷琴 王藹明 商 微 王偉周 李 敏 沈玉良

1 肇慶市西江醫院生殖中心(肇慶526000)2 海軍總醫院生殖中心(北京100048)

自發性流產在正常生育人群中占10%～15%，而在生育力低下的人群中所占比例更高[1]。目前，自發性流產的患者呈上升趨勢，其中將近50%為不明原因流產。這些不明原因流產患者夫妻雙方染色體核型分析正常，并且女方身體不存在解剖異常，其內分泌水平也在正常范圍內，自身免疫系統沒有明顯異常，不存在生殖道感染等常見疾病；而根據世界衛生組織標準對男性精液的精子濃度、形態和活力檢查也不存在異常。這些患者本身能懷孕，也說明了男方精子不存在數量不足、活力低下等問題。精子DNA損傷的是男性不育的一項新標準，很多醫院將這一項檢查納入了男性精子必查項目。精子DNA完整性對卵子受精、胚胎發育特別是8細胞以后的發育和著床等都是一個重要的影響因素[2]。有文獻報道，精子DNA損失與復發性流產有關，可能是其原因之一[ 3]。2011年，我們的臨床統計結果也認為精子DNA損失與復發性流產有一定關系[4]。目前，患者的就醫意識增強了，一般患者第一次流產后就會就醫，本研究比較流產一次的夫妻和正常夫妻男方精子DNA損失有無差異。

1 資料與方法

1.1 研究對象

通過對門診病歷的篩選，收集了31例有一次不明原因流產史的患者最為試驗組。試驗組納入標準是夫妻雙方染色體核型分析結果均為正常且均無家族遺傳病，沒有自愿人工流產史。同時女方無解剖及內分泌異常，沒有生殖道炎癥等常見病因。同時收集33例無流產史的患者作為對照組。對照組納入標準為夫妻有正常妊娠史，其中男性精液常規檢查無明顯異常。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑：主要用到的儀器是重慶光學儀器廠出產光學顯微鏡(型號為XSZ-HS7)。精子DNA損傷檢測試劑購自西班牙Halotech公司開發的試劑盒，主要包括凝膠、瑞氏染色液、細胞裂解液和細胞酸性變性等。

兩組的精液量、精子密度及活力均無差異，實驗組男方年齡(32.52)小于對照組(34.03)，有差異(P=0.03)，但實驗組的DFI(27.10)要高于對照組(22.25)，差異有統計學意義(P=0.002)。見表1。

表1精子DFI與流產的關系

2 討 論

和普通的體細胞相比，由于精子中的大部分組蛋白被魚精蛋白替換，其DNA高度致密化，增加了遺傳物質的穩定性。精子DNA鏈損傷可能會造成其功能缺失, 損傷機理主要有以下三種：第一，在精子形成過程中，染色質凝集不完全，特別是魚精蛋白的缺失，會造成精子DNA不穩定，導致DNA損傷。在動物模型中，敲除魚精蛋白基因后魚精蛋白缺失，精子DNA損傷，而且精子受精能力下降[6]。而在不育的男性中，約有5%～15%的男性缺乏魚精蛋白[7]。第二，細胞凋亡異常也許是引起的精子DNA損傷的一個原因，但這種觀點還存在爭議[8]。在精子發生過程中，75%以上的精子發生凋亡。這種選擇性的凋亡程序使得部分早期精子避免了凋亡，而不正常的精子一般都會發生凋亡[9]。Sakkas[8]等人認為可能某些DNA損傷的精子逃避了凋亡，這樣使得精液中的精子DNA損傷精子的比率有所增加。生精細胞表面上的Fas 蛋白結合可以與其配體(FasL) 結合，從而啟動生精細胞的凋亡程序。正常生育男性中Fas 陽性精子比異常者Fas 陽性精子少，說明這些人群中生精細胞清除DNA 受損精子的功能可能存在異常[10]。精子凋亡異常引起DNA 損傷精子比例增加也可能與半胱天冬酶(caspase) 激活有關[11]。McVicar[12]等人研究在射出體外的精子中凋亡標記物時發現，生育男性的精子未發現攜帶Fas，而畸形精子癥及弱精癥等精子參數異常的男性精子Fas 陽性率則較高。第三，氧化應激反應(oxidative stress)。正常生理濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS) 有利于精子的正常功能，但高濃度的活性氧可能導致精子DNA 單鏈或雙鏈部分斷裂從而造成DNA損傷，研究發現大約有25%～40%不育患者精液中存在高水平活性氧[13]。適當的氧化反應對精子功能有益，但過量的氧化反應對精子DNA會產生損傷。這是造成精子DNA損傷的一個重要原因[14]。

精子DNA損傷檢測方法有很多種，常用的有精子染色質結構分析(SCSA) 、精子染色質擴散分析(SCD)。精子DNA檢測一個重要的意義就是為男性不育提供參考，為助孕治療提供參考。與正常男性相比，不育男方的精子DNA損傷較高[15]。但不同方法的檢測結果閾值不同，還沒有一個統一的標準。精子染色質結構分析(sperm chromatin structure assay, SCSA)被公認為檢測精子DNA損傷的“金標準”，其檢測結果客觀、準確度高，但SCSA操作方法不便，且需要流式細胞儀等較昂貴的設備。Fernández等人發明了利用精子染色質擴散實驗檢測精子DNA損傷，這種方法操作相對簡單，不需要昂貴設備，一般醫療機構都有條件開展[5]。而且通過對比SCD與SCSA兩種檢測方法發現兩者有很高的一致性，這說明了SCD方法檢測精子DNA損傷同時具備結果準確可靠和費用低廉的優點[5]。

Bungum等運用SCSA法檢測精子DNA時發現當DFI > 30 %時， 人工授精的妊娠概率接近于零[16]。此外, 利用TUNEL 法評估精子DNA損傷發現，當DFI>12 %時不能正常妊娠，DFI在10%～12%之間會導致流產[17]。因此，在人工授精中DFI具有較好的評估預后作用。但有關精子DNA損傷與IVF/ICSI結局的關系尚無定論。Morris等認為精子DNA損傷比例增加與IVF 失敗相關[18]。而Ahmadi等研究發現，精子DNA損傷比例高的患者的受精率和正常人群沒有明顯差異，但囊胚形成率明顯降低并影響胚胎種植[19]。對最近的研究做比較分析可以看出，精子DNA損傷對輔助生殖結局存在一定的影響，但具體對什么產生影響，現在還沒有共識。存在這些分歧一方面是由于樣本量較小，另一方面可能是由于精子DNA損傷檢測方法不同；另外受精的過程中，本身就有一個選擇精子的過程，DNA受損的精子獲得受精存在一定的幾率，這樣結果可能就有較大差異。

從理論上講，胚胎發育到第三天的時候基因組被激活，父源基因開始起作用，如果DNA損傷嚴重，胚胎自身無法修復，這樣可能會導致胚胎發育潛力下降，囊胚形成率降低；甚至可能影響妊娠率，也可能引起流產。 有人研究發現高DFI與流產率有密切關系，行ICSI授精術的患者中高DFI組流產率顯著增加(P=0.009)。 Evenson等人采用SCSA方法檢測精子DNA，結果發現隨著DFI的增加妊娠幾率降低。而且在流產患者中，高DFI占39%[20]。近年，有多篇報道均精子DNA損失與習慣性流產有關，精子DNA損失率越高，流產的風險越大[21]。

但以上研究多以復發性流產患者為研究對象，還沒有人比較研究精子DNA損失與一次不明原因流產的關系，本研究就此做了對比研究。一般情況下，隨著男性年齡的增加DFI呈增高的趨勢[22]， 本研究結果發現對照組男方年齡顯著高于實驗組，但自發流產患者男性配偶的DFI明顯高于正常組。這更能說明不明原因的自發流產與男方精子DFI密切相關，隨著DFI的增加，流產風險增加。因此，對于流產的夫婦，男方精子DNA損失的檢測很有必要，不僅僅是復發性流產，對任何自發流產的患者都有必要檢查男方精子DNA的損失。

引起精子DNA損傷的原因有很多，如化療、放療，還有環境因素、生活節奏的加快、飲食、吸煙、酗酒等等。患有癌癥的年輕男性即使在癌癥治療前精子質量也會較差，精子DNA損傷嚴重。癌癥患者運用化療或者放療后，隨著藥物劑量的累積和放療時間的積累，會導致絕對的不育，說明目前化療藥物對生精功能有毒害[23]。放化療同樣會導致睪丸生精功能受損、精子DNA損傷增加[24]。男性生殖管道感染和炎癥(如附睪炎等)會導致白細胞增加進而引發白細胞精子癥，氧化應激反應增多，并由此造成精子DNA損傷增加[25]。據報道感染支原體和衣原體的男性，往往會導致精液質量下降，并且精子DNA損傷率增加，妊娠率下降[26]。

綜述所述，本研究結果與其他研究結果相符，精子DNA損傷會影響胚胎的發育潛力并增加流產風險。