ABCB1基因G2677T、C3435T多態性與阿托伐他汀降脂療效的關系

堵正潔 沈珍賢

1 無錫市惠山區人民醫院 (無錫 214151)2 南京醫科大學附屬無錫精神衛生中心 (無錫 214151)

近年來，隨著人們生活水平的提高，我國心血管疾病患病率及死亡率處于上升趨勢[1]。研究表明，心血管疾病的發生發展與血脂異常密切相關[2]。血脂異常是脂質代謝紊亂、轉運異常的表現，包括血清總膽固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高，以及血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低[3]。阿托伐他汀屬于羥甲基戊二酸輔酶A還原酶抑制劑，目前在臨床上廣泛用于降脂和穩定動脈硬化斑塊治療[4]。阿托伐他汀在體內主要通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶來抑制膽固醇的合成，從而使血漿TC、TG、LDL-C水平降低，同時使HDL-C水平輕度升高。然而，不同患者之間阿托伐他汀調脂療效差異較大[5]，有研究表明，阿托伐他汀是ATP結合盒亞家族B(MDR / TAP)成員1轉運蛋白(ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1,ABCB1)的基因表達產物——P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的特異性的轉運底物[6]。在已發現的ABCB1的近50個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)中，外顯子26的C3435T和外顯子21的G2677T/A 均能夠影響P-gp的轉運底物，很可能致阿托伐他汀療效的個體化差異出現[7]。目前國內對于ABCB1基因SNPs與血脂異常及調脂療效相關性研究比較少，故本研究率先從臨床的角度出發，初步探討了ABCB1基因G2677T、C3435T多態性與阿托伐他汀降脂療效的關系，為今后臨床的個體化降脂治療方案的制訂提供了依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2014年1月—2016年1月收集無錫市精神衛生中心血脂異常住院患者，受試者納入標準：符合2007年中國成人血脂異常防治指南[8]，患者血脂水平至少符合一項以下血脂參照標準，TC≥5.18 mmol/L，TG≥1.70 mmol/L，LDL-C≥3.37 mmol/L，HDL-C≤1.04 mmol/L；①研究前2周未服用過各類降脂相關藥物；②研究前2周未服用過影響血脂水平及影響阿托伐他汀代謝的藥物。

排除標準：①有繼發性血脂異常、活動性肝病、嚴重腎功能不全、對阿托伐他汀中任何成分過敏、嚴重創傷或重大手術者；②孕婦或可能受孕的育齡女性；③哺乳期婦女；④吸煙飲酒患者。

共收集205例漢族患者，其中男127例，女78例，年齡24～94歲，平均(65.65±13.65)歲，病程3～24個月，平均(13.10±6.02)個月。

1.2 試劑與儀器

氯仿、異丙醇、乙醇等為國產分析純試劑，使用時按需要配制。Reveres Transcription PCR相關試劑：焦炭酸二乙酯(DEPC)、Trizol RNA提取液、逆轉錄試劑盒，Taq聚合酶、100 bp DNA Ladder、瓊脂糖均購自大連寶生生物工程有限公司。PCR引物設計，該實驗采用的引物均為GenBank 獲取cDNA 全序列后，均由上海Invitrogen公司合成。

垂直電泳槽與 Gel DOC 2000 凝膠成像系統(美國Bio-RAD 公司),PCR擴增儀(德國 Eppendorf 公司),全自動紫外分光光度計Du640(美國Beekman公司)，高速冷凍離心機(德國Heraeus公司),羅氏全自動血生化分析儀Modlar P800(德國羅氏公司)。

1.3 治療方法與分組

患者均單一服用阿托伐他汀鈣膠囊(國藥準字H20051984，10 mg/片，天方藥業有限公司)20 mg每天，連續服用3個月。服藥期間的3個月除阿托伐他汀外均未服用過其他影響血脂水平及其代謝的藥物，無冠心病、高血壓病史、糖尿病，心電圖檢查均正常。治療3個月后均進行4項血脂指標檢測。將205例患者治療3個月后4項指標TC、TG、LDL-C、HDL-C恢復正常分為A組，治療后4項指標仍有一項及一項以上異常分為B組。

1.4 ABCB1基因分型

抽取外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝管中，-80℃保存。采用酚-氯仿法200 μL抽提DNA，紫外分光光度法測定各樣本DNA濃度。采用聚合酶鏈式反應—限制性片段長度多態分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP) 方法分析患者的基因分型。PCR引物序列為，ABCB1 G2677T正向引物：5′-AGTTTTCAGAAAATAGAAG CATGAGT-3′；反向引物：5′-GGGAGTAACAAAA TAACACTGATTAGA-3′。ABCB1 C3435T正向引物：5′-TGTGCTGGTCCTGAAGTT-3′；反向引物：5′-TAGGCAGTGACTCGATGAA-3′。PCR反應體系：反應總體積50 μL，包含Ex Taq (5U/μL),10× Buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol) 4 μL，模板DNA 2.5 ng，引物各1 μL；PCR反應條件：ABCB1 G2677T：94 ℃預變性3min，94 ℃變性30s，61 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，共35個循環，72 ℃再延伸7min，PCR產物片段351 bp。ABCB1 C3435T：94 ℃預變性3min，94 ℃變性40s，52.0 ℃退火 1min，72 ℃延伸 1min，共35個循環，72 ℃再延伸7min，PCR產物片段246 bp。酶切及電泳: 用NIaⅢ限制性內切酶酶切，37 ℃ 4 h后以15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察分型。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 患者的基本資料

對205例患者年齡、病程進行正態性檢驗，發現符合正態分布。其中，A組患者130例，男80例、女50例，年齡32～94歲、平均(67.00±12.44)歲，病程3～23個月、平均(12.78±5.93)個月；B組患者75例，男47例、女28例，年齡24～91歲、平均(63.32±15.34)歲，病程3～24個月、平均(13.68±6.17)個月。兩組患者的年齡、病程比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1患者年齡和病程分布

表3A組和B組ABCB1基因G2677T、C3435T基因型和等位基因頻率

2.2 ABCB1基因G2677T、C3435T基因型及等位基因頻率分布

經吻合度檢驗，患者基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明樣本來自同一蒙德爾群體，樣本具有代表性。205例患者中G2677T位點GG型、GT型、TT型基因頻率分別為19.51%、42.44%、38.05%；等位基因G和T頻率分別為40.73%和59.27%。C3435T位點CC型、CT型、TT型基因頻率分別為34.63%、49.76%、15.61%；等位基因C和T頻率分別為59.51%和40.49%。

G2677T位點A組與B組等位基因突變率為58.46%與60.67%，A組GG型、GT型、TT型基因頻率分別為23.08%、36.92%、40.00%，B組GG型、GT型、TT型基因頻率分別為13.33%、52.00%、34.67%；C3435T位點A組與B組等位基因突變率為40.77%和40.00%，A組CC型、CT型、TT型基因頻率分別為34.62%、 49.23%、16.15%，B組CC型、CT型、TT型基因頻率分別為34.67%、50.67%、14.66%。χ2檢驗結果顯示，A組和B組患者ABCB1基因G2677T、C3435T基因型和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2～3。

表2患者基因型分布(G2677T、C3435T)

2.3 用藥前ABCB1基因G2677T、C3435T多態性與4項血脂指標的關系

對205例患者用藥前4項血脂指標進行正態性檢驗，發現TG、TC、HDL-C、LDL-C經自然對數轉換后符合正態分布。服藥前，基因G2677T各基因型患者血漿TG、HDL-C水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；TT型患者血漿TC、LDL-C水平高于GT型患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，而GG型患者TC、LDL-C水平與分別與GT、TT型患者比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。基因C3435T各基因型患者血漿TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)見表4。

表4阿托伐他汀治療前ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型間血脂水平比較(M±Q)

與GT型患者比較：#P<0.05

2.4 用藥后ABCB1基因G2677T、C3435T多態性與4項血脂指標的關系

對205例患者用藥后4項血脂指標進行正態性檢驗，發現用藥后TG、TC、HDL-C、LDL-C經自然對數轉換后符合正態分布。服藥后，基因G2677T各基因型患者血漿TG水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；GT型患者血漿TC、HDL-C、 LDL-C水平低于GG型和TT型患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，而GG型與TT型患者TC、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。基因C3435T各基因型患者血漿TG、HDL-C水平比較，差異均無統計意義(P>0.05)；TT型患者血漿TC水平低于CC型和CT型患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，而CC型與CT型患者TC水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；TT型患者血漿LDL-C水平低于CC型患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，而CT型患者LDL-C水平分別于CC型、TT型比較無差異(P>0.05)。見表5。

表5阿托伐他汀治療后ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型間血脂水平比較(M±Q)

與GG、TT型患者比較：*P<0.05；與CC、CT型患者比較：#P<0.05；與CC型患者比較：**P<0.05

2.5 用藥前后4項血脂指標的比較

對阿托伐他汀用藥前后4項血脂水平的差值進行正態性檢驗，發現用藥前后血漿TC、HDL-C、LDL-C水平的差值服從正態分布，而TG用藥前后的差值經自然對數轉換后也達到正態分布。與用藥前相比，用藥后血漿TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，與用藥前比較差異均有統計學意義(P<0.001)。對于TG指標，由于其用藥前后差值不符合正態分布，經自然對數轉換后達到正態分布后進行配對t檢驗，用藥前Ln(TG)水平(0.42±0.51)高于用藥后Ln(TG)水平(0.23±0.36)，差異有統計學意義(P<0.001)，見表6。

表6 阿托伐他汀治療前后4項血脂水平比較(M±Q)

血脂指標用藥前用藥后PTG/(mmol/L)1.46±1.211.31±0.56#<0.001TC/(mmol/L)3.70±2.073.62±1.28#<0.001HDL-C/(mmol/L)0.82±0.291.09±0.16#<0.001LDL-C/(mmol/L)1.89±1.381.90±0.96#<0.001

與用藥前比較：#P<0.05

2.6 ABCB1基因G2677T、C3435T位點多態性與阿托伐他汀調脂療效的關系

ABCB1基因G2677T、C3435T各基因型患者血脂水平差值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表7。

表7ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型間阿托伐他汀用藥前后血脂水平差值比較

▲血脂水平用M±Q表示

3 討 論

本研究探討了阿托伐他汀的主要代謝酶ABCB1基因 G2677T、C3435T多態性與阿托伐他汀降脂療效的關系。ABCB1基因(多藥耐藥基因，MDR1)編碼的P-gp位于肝細胞、小腸上皮細胞頂端及近端小管刷狀緣，其功能是將藥物由細胞內轉運到細胞外，防止藥物及其代謝產物積聚細胞內引起毒性反應。ABCB1基因突變將導致P-gp表達異常或功能缺陷[9]，影響藥物在體內的代謝，導致阿托伐他汀不同的療效和不良反應。

隨著藥物基因組學和分子遺傳學的發展，發現ABCB1基因在不同種族人群中至少超過50個SNPs，其中位于編碼區域的C1236T、G2677T/A和C3435T 在不同種族人群中均有報道，被認為是影響ABCB1基因功能的3個最常見SNPs，具有重要意義。C1236T、G2677T/A、C3435T等位基因在中國人群的突變率較高，分別為71.9%(C1236T)、50%(G2677T)、12.5%(G2677A)和53.1%(C3435T)，且三者之間存在明顯的連鎖不平衡[10-14]。且有研究發現在女性高脂血癥患者中，ABCB1 3435C>T與阿托伐他汀的療效有關，服用阿托伐他汀后，CC基因型患者LDL-C下降最少，而各基因型HDL-C升高的幅度依次為CC>CT>TT[15]。臨床上已有ABCB1基因C1236T與阿托伐他汀調脂療效關系的研究，而本研究探討了ABCB1的另外兩個基因位點G2677T和C3435T的多態性與臨床阿托伐他汀對降脂的療效的相關性。

本研究結果顯示，ABCB1基因G2677T位點在治療后4項指標恢復正常人群中等位基因突變率為58.46%，治療后4項指標仍有一項及一項以上異常人群中等位基因突變率為60.67%；C3435T位點在治療后4項指標恢復正常人群和仍有一項及一項以上異常人群中等位基因突變率為40.77%和40.00%；ABCB1基因G2677T、C3435T位點基因型及等位基因頻率在治療后4項指標恢復正常人群和仍有一項及一項以上異常人群中分布并無明顯差異。205例患者中，用藥前ABCB1基因G2677T位點TT型血漿TC、LDL-C水平高于GT型(P<0.05)。用藥后ABCB1基因G2677T位點GT型血漿TC、HDL-C、LDL-C水平低于GG型與TT型(P<0.05)；用藥后ABCB1基因C3435T位點TT型血漿TC水平低于CC與CT型(P<0.05)，而CC型血漿LDL-C水平高于TT型(P<0.05)；綜上所述ABCB1基因G2677T位點和C3435T位點SNPs與血脂水平有關，可為臨床治療提供依據。經20 mg/d阿托伐他汀治療3個月后，血漿TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，說明阿托伐他汀具有良好的降血脂效果。而治療前后4項指標的差值與ABCB1基因G2677T、C3435T位點SNPs無關，說明ABCB1基因G2677T位點和C3435T位點SNPs可能與阿托伐他汀降脂療效無關。

目前，大部分有關基因多態性對他汀類藥物影響的研究，都只考慮某一種多態性對他汀類藥物的影響，而他汀類藥物在體內的代謝、轉運、產生藥效的過程十分復雜，影響因素眾多，單個遺傳決定因素難以全面反應多態性所致影響，同時考慮多個基因聯合效應更具現實意義[16]。阿托伐他汀的藥物基因組學研究是目前冠心病和動脈粥樣硬化治療領域中的新進展，有關藥物代謝酶、轉運體以及脂質代謝相關基因多態性對阿托伐他汀藥物療效的影響，國內外已有很多研究，但其仍處于一個起步階段，缺乏多個基因位點的單倍體研究，對于突變位點的功能意義研究尚需完善，缺乏多人種、多種族的大樣本研究，缺乏藥物轉運體與代謝酶對藥動學和藥效學影響的聯合研究[17]。有報道研究發現影響阿托伐他汀降脂效果的可能機制較多，并且除ABCB1 G2677T和C3435T多態性之外，其它位點的多態性也可能影響阿托伐他汀的降脂效果；而且同一基因不同位點的SNPs之間存在很多連鎖關系，單一位點的SNPs可能本身并不改變編碼蛋白質的表達而是通過與臨近的或潛在的與蛋白質表達相關的SNPs連鎖共同起作用[18]。有些因素如環境、藥物、飲食、運動之間相互作用等，也可能會影響血脂水平。

本研究并未測定患者血藥濃度，無法進一步分析結果；而且本研究只檢測了總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)4個指標，尚有其他血脂指標未進行檢測分析。所以本研究后期可以通過完善實驗方法，增加SNPs研究位點并分析相互之間連鎖關系，增加血脂指標檢測，盡可能消除影響因素，提高實驗設計的科學性、嚴謹性與合理性，進一步研究ABCB1基因G2677T、C3435T位點SNPs與血脂水平和阿托伐他汀調脂療效的相關性，從而為個體化治療提供臨床依據。隨著新技術及新研究方法的不斷改進完善，相信在不久的將來，阿托伐他汀的個體化降脂治療會更加完善。