血清外泌體對小鼠燙傷傷口愈合的促進作用及機制研究

郭建忠 楊 磊

1 惠州市中心醫(yī)院分院博羅縣人民醫(yī)院手足整形燒傷科(惠州 516100) 2 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院燒傷科(廣州 510515)

燙傷屬于皮膚外科常見的疾病類型，具有較高的發(fā)病率，通常是因為不小心接觸滾燙液體或者金屬所致，屬于一種意外人身傷害。特別是對于兒童群體而言，由于年齡和生活經(jīng)驗的原因，安全意識并不是非常高，可能接觸的高溫物體更頻繁，發(fā)生燙傷的可能性更大[1]。燙傷的危害性比較高，若燙傷后未得到及時有效的處理，則極有可能引發(fā)嚴(yán)重的后果，導(dǎo)致皮膚感染和壞死，影響外觀容貌的同時，甚至造成殘疾。外泌體由細(xì)胞分泌釋放而來，廣泛存在于全身各處，能夠與燙傷部位和創(chuàng)面直接發(fā)生接觸[2]。血清作為血液的主要成分，大量的外泌體存在其中，外泌體是否會對燙傷創(chuàng)面的愈合產(chǎn)生作用，若產(chǎn)生作用其機制又如何，目前臨床鮮有報道，因而加強對血清外泌體對燙傷創(chuàng)口愈合的作用和機制研究具有較高的價值和意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取60只NIH小鼠進行研究，對小鼠血液進行抽取，抽取后靜置60min，2000 r/min狀態(tài)下離心處理，離心處理結(jié)束15min后對血清予以分離。2000 r/min的狀態(tài)下離心處理，30min后將細(xì)胞碎片去除，并轉(zhuǎn)移至新離心管中，每支離心管血清含量為1 mL。對外泌體進行提取，提取時的操作必須以試劑盒及相關(guān)操作說明為準(zhǔn)，嚴(yán)格操作，保證質(zhì)量。外泌體提取完成后，檢測蛋白樣品的濃度(采用BCA法)，采取SDS-PAGE電泳處理，之后轉(zhuǎn)膜，TBS/T洗3次。脫脂奶粉在室溫環(huán)境下封閉處理(12 h)。TBS/T洗3次后加入一抗，冰箱孵育過夜，溫度4℃?；厥找豢梗琓BS/T洗3次，相對應(yīng)二抗加入，室溫環(huán)境下孵育，時間1 h。TBS/T洗3次，顯影、定影。

1.2 皮膚燙傷模型建立和血清外泌體治療

小鼠體質(zhì)量18～22g，麻醉藥物為10%水合氯醛，麻醉后對小鼠背部進行脫毛處理，同時常規(guī)消毒。小鼠背部方在燙傷裝置上造模，水浴鍋和隔熱木板為燙傷裝置的核心構(gòu)成部分，在隔熱板木板上設(shè)有孔徑6 mm的圓洞?？刂坪盟″伒臏囟葹?5℃，掌控好燙傷時間為8s。每只小鼠背部兩側(cè)各燙出直徑6 mm的圓形創(chuàng)面，選擇其中燙傷的一側(cè)，將100 μL PBS重懸的外泌體注射，另一側(cè)則在燙傷周圍注射100 μL PBS重懸外泌體，形成自身對照。見圖1～2。

圖1 為燙傷后皮膚組織情況(膠原纖維大量增生)

圖2 小鼠燙傷治療后皮膚組織的情況(皮膚壞死明顯恢復(fù))

1.3 MTT實驗

處于對數(shù)生長期的小鼠成纖維細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為1.5×104個/mL，每孔細(xì)胞懸液，劑量控制為相同100 μL(4組，每組3復(fù)孔)。觀察細(xì)胞貼壁情況，完全貼壁，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次。每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，加入3種濃度不同的外泌體懸液，空白組加入等量PBS，進行培養(yǎng)，時間為24 h，每孔將20 μL MTT加入其中，放置在培養(yǎng)箱中進行孵育，孵育時間為4 h，并將上層清液吸棄，每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻，10min后用酶標(biāo)儀對吸光值進行檢測。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗

處于對數(shù)生長期的表皮細(xì)胞HaCat接種于12孔板，接種密度為25×104個/mL。每孔加入1 mL細(xì)胞懸液(設(shè)置2組，每組3復(fù)孔)。觀察細(xì)胞貼壁情況，完全貼壁后每孔底部中間劃細(xì)線(使用200 μL槍頭操作)，培養(yǎng)液吸棄，PBS洗3次。DMEM培養(yǎng)基和外泌體懸液的加入及其培養(yǎng)同MTT實驗，使用顯微鏡拍攝細(xì)胞遷移情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件包，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體對小鼠燙傷創(chuàng)口愈合影響

動物整體實驗顯示，與空白對照相比較，采用血清外泌體后，小鼠燙傷創(chuàng)口愈合時間縮短，說明血清外泌體可以促進小鼠燙傷創(chuàng)口的愈合。見表1：

n燙傷創(chuàng)口愈合時間(d)空白對照組607.15±2.36血清外泌體組604.71±1.68t—6.524P—<0.001

2.2 血清外泌體對成纖維細(xì)胞增殖的影響

血清外泌體作用24 h后，PBS、2 μL Exo組、5 μL Exo組、10 μL Exo組均對成纖維細(xì)胞增殖產(chǎn)生了促進作用，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。在OD值方面，PBS為(0.63±0.12)，2 μL Exo組為(0.77±0.10)，5 μL Exo組為(1.06±0.09)，10 μL Exo組為(1.17±0.09)，各組OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，10 μL Exo組和PBS組外泌體除了呈現(xiàn)劑量依賴性外，還呈現(xiàn)一定的時間依賴性。10 μL Exo組OD值0d為(0.56±0.08)，第一天為(1.11±0.16)，第二天為(1.36±0.21)，第三天為(1.44±0.16)，各時間點OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PBS組OD值為(0.57±0.08)，第一天為(0.73±0.11)，第二天為(1.04±0.15),第三天為(1.12±0.14)；各時間點OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 血清外泌體對表皮HaCat細(xì)胞遷移影響

HaCat細(xì)胞的遷移會受到血清外泌體的顯著影響，外泌體組和PBS組24 h的HaCat細(xì)胞遷移率相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2：

nHaCat細(xì)胞遷移率/%外泌體組6064.03±5.12PBS組6032.89±4.03t—37.019P—<0.001

3 討 論

外泌體于1983年被發(fā)現(xiàn)，但是一直以來臨床對其的重視程度都比較低。近年來，臨床對外泌體的研究逐漸增多，大量的研究實踐表明外泌體在免疫中抗原呈遞、組織損傷的修復(fù)、腫瘤的生長和遷移等方面有著十分顯著的作用[3]。

燙傷作為臨床皮膚外科常見的疾病類型，組織的修復(fù)對皮膚的健康恢復(fù)至關(guān)重要。一般而言，受損皮膚組織的修復(fù)，不僅能依靠原來性質(zhì)的細(xì)胞進行修復(fù)，這樣的修復(fù)效果往往不夠理想。研究表明，通過成纖維細(xì)胞增生填補受損的組織，可以很大程度上提升傷口的愈合率[4]。在繁殖速度方面，成纖維細(xì)胞比較快，快速的繁殖速度，能夠在很大程度上較快合成和分泌膠原纖維與基質(zhì)成分與新生毛細(xì)血管形成肉芽組織的速度，形成的新肉芽組織，用于填補壞死皮膚組織，從而為表皮細(xì)胞覆蓋創(chuàng)造良好的條件[5]。隨著燙傷修復(fù)進程的推進，硬痂會不斷脫落，表皮細(xì)胞的遷移也會隨之完成覆蓋[6]。血清外泌體廣泛存在于血清中，其直徑大約為40～100 nm，在血液等體液內(nèi)傳播，其作用機制表現(xiàn)為：攜帶mRNA，MicroRNA和蛋白質(zhì)等生物活性分子，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，發(fā)揮相應(yīng)的功能作用[7]。血清中含有大量的外泌體，本研究針對性地研究了血清外泌體對燙傷傷口創(chuàng)面愈合的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其作用是積極的，尤其是在縮短創(chuàng)面愈合的時間方面作用顯著，與此同時，對于血清外泌體對成纖維細(xì)胞增殖，表皮HaCat細(xì)胞遷移會也會形成積極的作用，可以促進二者的增殖和遷移，而這也能夠在一定程度上用于解釋對燙傷傷口創(chuàng)面愈合的積極影響。此外，本研究血清外泌體的給藥方式為皮下注射，與傳統(tǒng)外敷涂抹用藥不同的是，該給藥方式幾乎不受皮膚通透性的影響，效果更明顯，作用更為直接[8]。

綜上所述，血清外泌體通過對成纖維細(xì)胞增殖和表皮HaCat細(xì)胞遷移會產(chǎn)生促進作用，進而作用于燙傷傷口創(chuàng)面的愈合，這在很大程度上為皮膚燙傷的治療提供了更多有價值的參考信息。