福建牡蠣新基因SMRP1的功能分析

楊丙曄，李瑩，陳仲巍，*

（1.廈門醫(yī)學院廈門市醫(yī)用海洋天然產物與細胞工程重點實驗室，福建 廈門 361023；2.廈門大學海洋與地球學院，福建 廈門 361005）

基因的表達在個體發(fā)育的不同階段以及不同的組織甚至細胞類型中是不同的，也叫基因表達的時空差異[1]。對一個基因的時空表達譜進行研究分析，是研究一個未知基因功能的基礎，原位雜交技術從1969年創(chuàng)立以來已經(jīng)分化成兩個大的方面的應用，整體原位雜交和組織切片原位雜交。整體原位雜交主要用于檢測特定基因在生物體的不同發(fā)育時期表達位置的分析，組織切片原位雜交主要用于檢測基因在生物體的組織或細胞中的特定位置的表達分析，兩者可以相輔相成地對基因表達特異器官或組織定位進行分析，進而將基因的功能與生物體的發(fā)育過程相聯(lián)系[2]。定量即時聚合酶連鎖反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）主要有半定量 RT-PCR，實時定量RT-PCR 和競爭性定量RT-PCR 3 種，其中實時定量RT-PCR 以其特異性強和自動化高的特點得到廣泛的應用[3]。本研究利用實時定量RT-PCR 對SMRP1 在福建牡蠣不同發(fā)育階段幼體和不同組織器官的特異性表達進行研究，繼而用原位雜交技術對福建牡蠣不同發(fā)育階段幼體和高表達組織中進行定位研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

熒光定量Mix：美國Thermo 公司；反轉錄試劑盒：日本TaKaRa 公司；TRIzol 試劑、抗地高辛抗體：美國Roche 公司；NBT/BCIP 顯色試劑盒：中國索萊寶生物公司。

Gemini AS 自動組織脫水機、ASP300S 自動染色機：Thermo Fisher；EG1140 石臘包埋機、RM2235 輪轉式切片機：Leica；YKN-ECA-FZ01 雜交爐：Midwest；BX53多功能顯微鏡：Olympus。

1.2 SMRP1基因在牡蠣幼體不同發(fā)育時期轉錄組文庫表達分析

通過對福建牡蠣幼體5個不同時期的轉錄組文庫比對分析獲得SMRP1 基因序列。使用Bioedit 軟件，從實驗室構建獲得的福建牡蠣幼體5個不同時期的轉錄組文庫數(shù)據(jù)中搜索SMRP1 基因的有效序列，依據(jù)SMRP1 基因在轉錄組文庫中的有效序列制作SMRP1 基因在福建牡蠣幼體6個不同發(fā)育時期的表達圖。

1.3 SMRP1基因在牡蠣幼體不同發(fā)育時期和不同組織的qRT-PCR表達分析

從育苗場分別獲得6個不同時期的福建牡蠣幼體：擔輪幼體、D 形幼體、殼頂幼體、眼點幼體、附著變態(tài)幼體和稚貝，將幼體集中收集到培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中逐滴加入1 mol/L 的MgCl2溶液，并且不時的在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)幼體從浮游狀態(tài)到沉到底部且組織器官沒有活動跡象時，將幼體收集到1.5 mL 的離心管中，將含有MgCl2的海水盡量吸取干凈，加入4%的多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA））。每個時期幼體取3組平行樣品。從廈門市第八市場獲取新鮮捕撈的福建牡蠣成體，解剖后獲得牡蠣7 種不同組織樣品，每個組織樣品獲取3個平行樣品。樣品加入TRIzol 試劑，依據(jù)TRIzol 試劑提取的方法提取不同樣品的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），ND-1000 測定 RNA 的濃度。使用TaKaRa 公司的反轉錄試劑盒，以1.5 μg 總RNA 作為反轉錄模板，制備不同發(fā)育時期和不同組織的互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）文庫，設計 SMRP1 基因特異性引物（表1），以反轉錄產物稀釋10 倍為模板，18S 核糖體RNA為內參基因，用ABI7500 熱循環(huán)儀檢測SMRP1 基因在福建牡蠣幼體不同發(fā)育時期的表達變化[4]。熒光定量的數(shù)據(jù)處理采用公式：N=2-ΔCt(Ct-18)（Ct 代表熒光定量熱循環(huán)儀所采集到循環(huán)數(shù)）。

不同發(fā)育階段的表達數(shù)據(jù)比較采用SPSS 軟件分析差異。

表1 引物序列Table 1 List of primers sequences

1.4 SMRP1基因在福建牡蠣鰓和外套膜中的表達定位分析

利用設計的SMRP1 基因特異性引物（表1），PCR擴增獲得429 bp SMRP1 基因片段，將429 bp 的片段克隆到PGEM-T EASY 載體中，測序確定PGEM-T EASY 載體中SMRP1 基因拍片段的正確性，利用克隆好的PGEM-T EASY 載體為模板，擴增獲得帶有T7 和SP6 啟動子序列的DNA 片段。使用DIG-RNA labeling Kit 試劑盒獲得SMRP1 基因的特異原位雜交探針。

切片原位雜交：解剖新鮮采購的福建牡蠣成體，獲得鰓和外套膜組織，將組織樣品固定于4%的多聚甲醛溶液中，4 ℃固定過夜。磷酸緩沖液洗3 次，每次10 min，然后依次浸泡于25%、50%和75%乙醇溶液中各10 min。然后進行樣品的透明和包埋。將包埋好的樣品用組織切片機切片，切片的厚度為5 μL，切片展片于多聚賴氨酸包埋好的載玻片上，42 ℃烘烤3 h。然后參考牡蠣性腺切片原味雜交的方法[5]，對牡蠣鰓和外套膜進行表達定位試驗。

紅琴笑靨如花，像盅惑人的林中女妖。她的身上散發(fā)出一種奇異的幽香，與林中的草木的氣息混合在一起，形成一種令人沉醉的芬芳。風一吹，樹上有幾片黃葉飄落下來。你真的要離開我？她問。他沒有回答，以往總是她逃離茶莊，去山下的小村子。她做夢也沒有想到，有朝一日他也會離開茶莊，離山下的紅塵世界越來越遠，直至像一朵云一樣飄走。她害怕了，莫非他還要再次出家，重新皈依佛門，遁入空門去白云寺當和尚？如果真是這樣，這一次他一定是看破了紅塵，一定會受戒的。她突然大聲尖叫起來，不，你不能走！我不讓你走！

1.5 SMRP1基因在牡蠣幼體發(fā)育過程中的組織定位分析

從育苗場分別獲得3個不同發(fā)育時期的牡蠣幼體：D 形幼體、殼頂幼體、和眼點幼體，取樣方法參照文章1.3 部分，幼體4 %的多聚甲醛固定之后，分別用25%、50%、75%和100%甲醇脫水，每次5 min。最終在100%的甲醇中-20 ℃保存待用。整體原位雜交參照在海鞘生物中的試驗方法[6]。

2 結果與分析

2.1 SMRP1基因在牡蠣幼體不同發(fā)育時期和不同組織的表達分析

通過比對分析福建牡蠣幼體5個不同時期的轉錄組文庫獲得SMRP1 基因序列。對獲得的SMRP1 的核酸和蛋白序列的分析如圖1所示，全長1 468 bp，編碼396 氨基酸。核酸序列含有一個起始密碼子和終止密碼子，且在序列后部含有一個加尾信號。

利用不同發(fā)育時期的轉錄組文庫分析SMRP1 在幼體不同發(fā)育階段的表達情況，結果如圖2所示，SMRP1 基因在牡蠣幼體的6個發(fā)育時期中眼點幼體、變態(tài)過程中和稚貝時期表達相對較高，尤其是在變態(tài)過程中表達最高。通過qRT-PCR 檢測驗證發(fā)現(xiàn)，SMRP1基因除了在變態(tài)前后時期和變態(tài)過程中表達很高之外，在殼頂?shù)某跗诒磉_量也相對會高些。

圖1 SMRP1基因的核酸和蛋白序列分析Fig.1 SMRP1 cDNA sequence and protein sequence analysis

圖2 SMRP1基因組在不同發(fā)育時期幼體表達Fig.2 SMRP1 gene expression pattern during different development stages

2.2 SMRP1基因組織特異性表達分析

qRT-PCR 檢測結果如圖3所示。

圖3 SMRP1基因在不同組織器官的表達結果Fig.3 SMRP1 gene expression pattern from different tissues

由圖3可知，SMRP1 基因在牡蠣中具有明顯的組織特異性。SMRP1 基因在外套膜和鰓組織中表達量明顯高于其它組織，特別是在外套膜中的表達量尤其高。

2.3 SMRP1基因在鰓組織中的表達定位分析

利用組織原位雜交技術，獲得SMRP1 基因在福建牡蠣鰓組織中的表達定位結果如圖4所示。

圖4 SMRP1 mRNA在鰓組織中的空間表達分析Fig.4 SMRP1 mRNAspatialexpression analysis in gill tissue

SMRP1 基因主要在福建牡蠣鰓主鰓絲的普通鰓絲外表皮細胞中，還有表達在瓣間連接的一些外表皮細胞上。

2.4 SMRP1基因在外套膜組織中的表達定位分析

利用組織原位雜交技術，獲得SMRP1 基因在福建牡蠣外套膜組織中的表達定位結果如圖5所示，SMRP1 基因主要表達在牡蠣外套膜組織邊緣的外表皮細胞中。

圖5 SMRP1 mRNA在外套膜組織中的空間表達分析Fig.5 SMRP1 mRNA spatial expression analysis in mantle tissue

2.5 SMRP1基因在幼體不同發(fā)育時期的組織定位分析

利用整體原位雜交技術，獲得SMRP1 基因在牡蠣不同發(fā)育時期幼體中的表達分析結果如圖6所示。

圖6 SMRP1 mRNA在不同發(fā)育時期幼體空間表達分析Fig.6 SMRP1 mRNA spatial expression analysis in different development stages

SMRP1 基因從牡蠣殼頂幼體初期開始大量表達，且可以觀察到SMRP1 基因在殼頂時期集中表達在身體中部偏殼開口的位置。幼體發(fā)育到眼點時期可以明顯的觀察到SMRP1 基因大量集中表達在外套膜的邊緣位置。

3 討論與結論

福建牡蠣是我國重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類，特別是在福建沿海地帶，是牡蠣的主要養(yǎng)殖貝類，福建牡蠣是典型的濾食性動物，濾食性貝類鰓的作用非常重要，具有呼吸和攝食的雙重作用[7]，海水被牡蠣吸入體內后，流經(jīng)鰓組織，鰓絲上的纖毛一方面有過濾食物的作用，通過纖毛的運動將食物運到口處，另一方面的功能可以進行氣體交換。所以鰓的生長與發(fā)育直接影響到牡蠣的生長發(fā)育。

通過對福建牡蠣幼體不同發(fā)育轉錄組庫分析發(fā)現(xiàn)幼體附著變態(tài)時期高表達基因SMRP1，SMRP1 主要分布在牡蠣鰓的主鰓絲和普通鰓絲的上皮細胞里，這些柱狀的上皮細胞具有非常重要的作用，他們通過控制自身上的纖毛來控制對食物的運送。SMRP1 基因還有一個主要分布區(qū)就是在瓣間連接上的扁平細胞里，瓣間連接是由2 排單層扁平細胞及其腔隙構成，腔隙內為含血腔的結締組織。瓣間連接的扁平細胞區(qū)是牡蠣的呼吸上皮區(qū)[8-9]，是鰓絲與外界進行氣體交換的部位。由此可見SMRP1 基因的主要表達在鰓組織的2 大功能區(qū)域。SMRP1 基因的功能是與生長發(fā)育密切相關的，可見SMRP1 基因對福建牡蠣鰓組織的生長和發(fā)育起著重要的作用，進而直接影響牡蠣進食和呼吸。

貝類外套膜組織形態(tài)學和組織化學方面的研究已經(jīng)很多[10-11]，牡蠣的外套膜有左右2 片，每片由外側上皮細胞、內側上皮細胞和中央的結締組織組成，外套膜的邊緣分成3 部分，外層、中層和內層，外層稱為生殼突起，主要功能是分泌貝殼，中層稱為感覺突起對外界刺激反應靈敏，專司感覺作用；內層稱為緣膜突起可以伸展和收縮，控制進水孔的通道，具調節(jié)水流的作用。外層殼側的表皮細胞中含有大量的嗜堿性粒，推測是堿性磷酸酶的酶原粒，該酶是碳酸鈣結晶的關鍵酶[12-13]，所以外套膜殼側的表皮細胞對貝殼的生長具有重要的作用。而中層的感覺作用主要也是通過其突起的表皮細胞來完成的。跟生長密切相關的SMRP1 基因集中分布在外套膜的表皮細胞中，對外套膜表皮細胞生長的調節(jié)具有非常重要的作用。

綜上所述，SMRP1 基因主要表達在外套膜和鰓的關鍵功能區(qū)域的表皮細胞中，對外套膜和鰓的生長發(fā)育具有重要的調控作用，從而直接影響了其組織功能的發(fā)揮。