Dmrt基因在斜帶石斑魚胚胎發育不同階段的表達分析

胡 娟，林芳妹，呂晴霽，王 慶，楊慧榮，石和榮，趙會宏

（1.華南農業大學海洋學院，廣東 廣州 510640；2.廣東省海洋漁業試驗中心，廣東 惠州 516081）

【研究意義】 斜帶石斑魚（Epinephelus coiodes）為鱸形目（Perciformes）鮨科（Serranidae）石斑魚屬（Epinephelus）魚類，分布于熱帶、亞熱帶海域，是我國南方沿海（海南、廣東、廣西、福建等）重要的海水經濟養殖魚類[1-2]。斜帶石斑魚雌雄同體，屬于先雌后雄的魚類，目前對調控斜帶石斑魚性逆轉的機制尚未清楚。

【前人研究進展】 具有保守DM結構域的轉錄因子(Double-sex and mab-3 relatated transcription factor，Dmrt）基因是指與果蠅 Dsx 基因和線蟲Mab-3 基因同源的基因家族，Dmrt 基因家族由其DNA結合（DM）結構域分類，包括一組非經典的鋅指，高度保守的DM結構域的特征在于其穩定兩個鋅離子的能力，每個鋅離子位于由3個半胱氨酸和組氨酸配位的疏水核心內[3-6]。Dmrt 基因家族編碼具有保守DNA結合域的轉錄因子，其在魚、爬行動物、鳥類和哺乳動物的性腺中高度表達[7]。Dmrt 家族有多種功能，其生理作用涉及性別決定、胚胎發育、體節發育、組織器官形成以及調控肌肉發育等多個方面[8]。Dmrt 基因家族在不同的脊椎動物中數目不同，目前在小鼠中發現了 Dmrt1 ～ Dmrt8，在雞中發現了 Dmrt1 ～ Dmrt3，在鳥類中發現了 4個家庭成員，在魚類中發現了 Dmrt1 ～ Dmrt5[9]。Dmrt1 在魚類中主要參與雄性調控，其沉默或基因突變會使青鳉魚(Oryzias latipes)雄性逆轉。青鳉魚Dmrt1 Y 的第3個外顯子包含1個氨基酸突變，會導致DMY的翻譯提前終止，不能表達完整的DMY蛋白，失去DMY蛋白功能導致魚發生了性別反轉[10-11]。有研究基因敲除半滑舌鰨Dmrt1，證明 Dmrt1 是半滑舌鰨雄性性別決定基因。Dmrt2是魚類發育研究中的一個重要基因，主要參與胚胎發育和配子的形成；通過對 Dmrt2表達譜研究發現，其參與青鳉和斑馬魚的性別發育，參與雞與小鼠的性別胚胎發育[12]。Dmrt3 在發育中的小鼠前腦和脊髓中某些中間神經元中被檢測到，在馬和小鼠中起到運動協調器的作用；人類 Dmrt3 的順式調節元件缺失可能導致前腦發育受損和步態異常[13]；Dmrt3 在河豚（Takifugu rubripes）的器官發育以及斑馬魚神經系統中表達，也在性腺中表達[14]。Dmrt4 在生物上普遍存在選擇性剪接現象及對雌性發育起重要作用，目前在奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）、稀有鮈鯽（Grobiocypris rarus）等生物中發現了其不同剪接體[15-16]。Dmrt5 有助于調節細胞周期進程和神經元分化之間的微調，且Dmrt5通過調控 Cxxc4表達，從而抑制Wnt/β-catenin信號來影響早期胚胎頭部的發育[17]；Dmrt5 在斑馬魚中缺失會導致皮質顯著減少，同時神經元數量減少。

【本研究切入點】 鑒于Dmrt 基因在斜帶石斑魚胚胎發育過程中的表達情況目前尚未清楚，本研究以Ecdmrt1、Ecdmrt2、Ecdmrt3基因為試驗對象，研究這3個基因在斜帶石斑魚胚胎發育不同階段的表達，為今后進一步研究斜帶石斑魚性逆轉奠定基礎。【擬解決的關鍵問題】 以斜帶石斑魚為研究對象，了解其胚胎發育過程及性腺不同時期 Dmrt 基因家族的表達模式，以期掌握Dmrt 基因家族在雌雄同體雌性先熟魚類中的變化趨勢，有助于我們深入研究 Dmrt 基因家族在胚胎發育中的調控作用，進一步確定 Dmrt 家族參與發育的相關基因，為揭示該類基因的表達規律及在魚類胚胎發育中的功能，為探索斜帶石斑魚性逆轉機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的斜帶石斑魚來源于廣東省海洋漁業試驗中心。受精卵于室內以自然產卵方式取得，倒入提前備好的 1 L 燒杯中，在室內恒溫（24±0.5℃）、靜水中孵化。用顯微鏡觀察胚胎的發育，分別取分裂期、囊胚期、原腸期、神經胚期、器官形成期、初孵仔魚期的胚胎保存于RNAlater中，每組 5 個平行，作為提取 RNA 樣品，4 ℃過夜，-20℃ 低溫保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據 NCBI 中的斜帶石斑魚Dmrt1 基因序列和斜帶石斑魚基因組基因庫（與華大基因合作）中的斜帶石斑魚 Dmrt2/2b/3 基因序列，利用 Primer Premier5.0 軟件設計特異性引物（表1）。

表1 熒光定量引物的設計Table 1 Sequences of the primers for fluorescence quantification

1.2.2 RNA 提取及 cDNA 模版的制備 總 RNA的提取按照 Trizol?reagent（Invitrogen, USA）說明書進行操作，再反轉錄成 cDNA 模板，用于熒光定量 PCR。

1.2.3 熒光定量 PCR 及數據分析 以 cDNA 為 熒光定量PCR 模板，選取 β-actin 作為內參基因。選用 SYBR Green Real time PCR Master Mix plus kit（TOYOBO，Japan）試劑盒進行熒光定量PCR 試驗。反應程序為：95 ℃ 預變性 4 min；95 ℃ 變性 15 s、55 ℃ 退火 15 s、72 ℃ 延伸 20 s，共 40 個循環；84℃下收集熒光。分析溶解曲線，確定熒光定量PCR 的質量，根據Ct值利用2-ΔΔCt法初步處理數據，再利用 Graphpad Prism5.0 軟件對數據進行處理和分析，當P＜0.05 時認為差異顯著。

1.2.4 構建系統進化樹 使用 Clustal X和MEGA 5.0 軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）將不同種類動物的 Dmrt 基因家族編碼的氨基酸序列進行分析比對，并構建 Neighbour-joining 系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 斜帶石斑魚胚胎發育過程

斜帶石斑魚受精卵（圖1-1）直徑780～880μm，在（24±0.5）℃ 、鹽度 31.0 的海水中培育，歷時約 29 h 50 min 完成整個胚胎發育過程，進入胚后發育階段。

2.1.1 卵裂期 斜帶石斑魚的卵裂方式屬于盤狀卵裂。受精后約30 min，受精卵動物極開始形成胚盤（圖1-2）。受精后約 45 min，胚盤出現第1次分裂，將胚盤分裂為兩個大小相等的橢圓形細胞（圖1-3）。受精后約55 min，胚盤開始第2 次分裂，將上一次分裂的每個細胞平均分為兩個細胞（圖1-4），進入 4 細胞期。受精后1 h 20 min，開始第3次卵裂，進入 8 細胞期（圖1-5）。

受精后約 1 h 40 min，胚盤第4次分裂，進入 16細胞期（圖1-6）。受精后約 2 h，胚盤第5次分裂，進入 32 細胞期，此時細胞直接界限不清晰，失去規則（圖1-7）。受精后約 2 h 30 min，胚盤第 6 次分裂，進入 64 細胞期，此時細胞排列不規則且大小性狀不同（圖1-8）。受精后約 3 h，細胞漸漸變小且重疊在一起，其性狀為方形輪廓，此時進入多期（圖1-9）。受精后約 3 h 30 min，細胞變得更小、界限更難以分辨，形成許多小球狀的細胞排列成一團，近似圓形，此時胚胎進入桑葚期（圖1-10）。

2.1.2 囊胚期 受精后約 4 h 30 min，細胞繼續分裂，細胞數目和層次不斷增多，使得胚盤與卵黃間直接形成囊胚腔，囊胚中部向上隆起，出現帽狀性狀，此時進入高囊胚期（圖1-11）。此后囊胚隆起的部分不斷變低，受精后約 5 h 55 min，囊胚隆起部變得更低，胚盤細胞向周圍發展，呈扁平帽狀于卵黃上，此時胚胎進入低囊胚期（圖1-12）。

2.1.3 原腸胚期 低囊胚期后，囊胚邊緣細胞逐漸增加且胚層細胞從動物極向植物極方向遷移和下包，受精后約 7 h 30 min，卵黃被胚層包圍 1/4（圖1-13），此時胚胎進入原腸早期。此后可見到胚層一端形成一個胚盾，胚層下包約卵黃 1/2（圖1-14），此時胚胎已經進入原腸中期。受精后約11 h 15 min，胚層下包大部分卵黃（約 3/4），胚盾逐漸變得細長（圖1-15），此時胚胎進入原腸晚期。

圖1 斜帶石斑魚胚胎發育過程Fig.1 Embryonic development process of Epinephelus coioides

2.1.4 神經胚期 受精后約 12 h 40 min，胚盾延伸到植物極，胚體背面增厚，神經板形成，視野可見到 1條圓柱形脊索（圖1-16），胚胎發育進入神經胚期。

2.1.5 器官形成期 受精后約 14 h 30 min，在脊索頭部兩端出現 1 對視囊（圖1-17）。受精后約16 h，胚體出現明顯的肌節（圖1-18）。受精后約 18 h 20 min，肌節達到 10 對以上，且胚體視囊中還出現橢圓形腦泡（圖1-19）。受精后約 23 h 40 min，在顯微鏡下可看到胚胎心跳，脊索神經管明顯（圖1-20）。受精后約28 h，在顯微鏡下可看到胚胎內胚體抽動（圖1-21）。受精后約29 h 20 min，部分胚胎內的小魚開始孵化，小魚頭部先伸出，然后尾部用力不斷抖動脫去卵膜（圖1-22）。受精后約 29 h 50 min，大部分胚胎孵出仔魚，其仔魚懸浮于水體表層，沒有運動能力，且腹部膨大（圖1-23）。

2.2 胚胎發育過程中 Dmrt 基因的表達

定量 PCR 分析結果表明，斜帶石斑魚 Dmrt基因（Ecdmrt1）在胚胎發育過程中均從卵裂期開始表達。Ecdmrt1 基因囊胚期表達水平達到峰值，卵裂期和初孵仔魚期表達量較低（圖2A），Ecdmrt1 基因在囊胚期表達是分裂期的 5.4 倍。Ecdmrt2 基因在胚胎初期相對表達量比較平穩，神經胚期表達量顯著上升，是分裂期的 9.2 倍；Ecdmrt2 基因在初孵仔魚中表達水平最高（圖2B），是分裂期的 17.6 倍。Ecdmrt2b 基因在胚胎發育過程中表達量逐漸增加，在器官形成期表達量達到峰值（P＜0.05）（圖2C），在初孵仔魚中表達水平又下降。Ecdmrt3 基因在胚胎發育初期表達量相對較低，在器官形成期時表達量顯著上升，是分裂期 7.1 倍，在初孵仔魚中表達量達到峰值（圖2D）。

2.3 Dmrt家族系統進化樹

對 GenBank 數據庫上能搜索到的不同脊椎動物 Dmrt 家族成員氨基酸序列及由Ecdmrt1、Ecdmrt2、Ecdmrt2b、Ecdmrt3推測出來的氨基酸序列進行比對。采用MEGA6 軟件，利用NeNeighbor Joining 法構建系統進化樹，結果（圖3）表明，Ecdmrt1與鯽魚Dmrt3、Ecdmrt2與黃鱔 Dmrt2b、Ecdmrt2b 與斑馬魚 Dmrt2b、Ecdmrt3與小家鼠 Dmrt1最為接近。Ecdmrt2 與Ecdmrt2b聚為一族，再與 Ecdmrt3 聚為一族。可以看出，Ecdmrt2與 Ecdmrt2b 在進化上很接近，與 Ecdmrt1親緣關系較遠。

圖2 Dmrt 基因在斜帶石斑魚不同胚胎發育時期的表達水平Fig.2 The expression level of Dmrt in different embryonic development stages of Epinephelus coioides

圖3 采用 Neighbor Joining 方法構建的不同物種 Dmrt家族系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Dmrt family generated with Neighbor Joining method

3 討論

3.1 斜帶石斑魚的胚胎發育

本研究結合斜帶石斑魚胚胎發育的結果，且參照石斑魚發育階段的劃分[18]，可將斜帶石斑魚胚胎發育過程劃分為卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期和器官形成期。其胚胎發育符合硬骨魚類胚胎發生的普遍規律，但胚胎發育過程中器官發育的先后順序不同，但其他方面與常見石斑魚的胚胎發育過程一般規律相似[19-20]。

3.2 Dmrt1基因在胚胎發育不同時期的表達

Dmrt1基因在河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）不同胚胎時期均有表達，但其表達量隨著河川沙塘鱧的不斷發育呈先上升后下降的趨勢，尤其在原腸胚時期達到最高值，顯著高于其他發育階段[21]。Dmrt1 基因在黃河鯉 （Cyprinus carpio）胚胎發育各個時期都有表達，表達量呈先上升后下降，在原腸胚期表達量最高[22]。Dmrt1基因在香魚（Plecoglossus altivelis）胚胎發育過程中均有檢測，但其在原腸期表達量達到最大值[23]。同樣Ecdmrt1基因在胚胎發育過程均有表達，其表達與河川沙塘鱧、黃河鯉等情況一樣，先上升后下降，但其在囊胚期表達量最高，其次是器官形成期。根據以上結果，Ecdmrt1 參與整個胚胎發育過程，推測該基因在斜帶石斑魚胚胎發育過程中也扮演著重要角色。Ecdmrt1在囊胚期表達量最高，而在硬骨魚中，原始生殖細胞 （PGCs）最早發現于原腸胚時期，且原腸期與原始生殖細胞的產生有關[23-24]，因此，Ecdmrt1 在囊胚期可能為形成生殖細胞做好準備。其次 Ecdmrt1 在器官形成期表達量較高，推測 Ecdmrt1 基因可能參與器官的形成。

Dmrt2a在斑馬魚（Danio rerio）以及青鳉（Oryzias latipes）中主要于體節形成前和正在發育的體節中表達。Dmrt2a在金魚（Carassius auratus）胚胎發育體節形成中表達量比其他時期顯著[25]。Dmrt2b在金魚受精后 12 h 表達，其表達過程與斑馬魚相似，但斑馬魚 Dmrt2b在受精后 6 h 開始表達，且從受精后 16～48 h 出膜時表達水平相對穩定，并通過 Hedgehog 信號通路參與體節發育過程[26]，而 Dmrt2b在金魚出膜后仔魚表達量顯著增加。Ecdmrt2基因在斜帶石斑魚胚胎初期相對表達量比較平穩，且在初孵仔魚中表達水平最大,與 Dmrt2b在金魚中的表達相似[25]。Ecdmrt2b基因在胚胎發育過程中表達量逐漸增加，在器官形成期表達量達到峰值，在初孵仔魚中表達水平又下降。根據以上結果推測，Ecdmrt2b基因可能參與器官形成，而 Ecdmrt2基因可能參與仔魚生長發育。

Dmrt3基因在鯽魚（Carassius auratus）的尾芽期開始有微量表達，在 15 體節期表達量有所增加[27]。Dmrt3 基因在爪蟾（Xenopus tropicali）胚胎早期發育的各個時期均有表達，主要在嗅覺原基、端腦、側線原基、神經管等部位特異性表達[28]。而 Ecdmrt3基因在石斑魚的胚胎發育初期表達量相對較低，在器官形成期表達量顯著上升，在初孵仔魚中表達量達到峰值。根據以上結果推測，Dmrt3的功能可能發生了歧化，在不同物種中有不同的功能，Ecdmrt3基因在石斑魚中可能參與生長發育。

4 結論

斜帶石斑魚的胚胎發育符合硬骨魚類胚胎發育規律，劃分為卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期和器官形成期。Ecdmrt基因家族都是從卵裂期開始表達，Ecdmrt1在囊胚期表達量最高，而原始生殖細胞（PGCs）與原腸胚時期有關，推測與形成生殖細胞有關；Ecdmrt1在器官形成期表達量較高，推測 Ecdmrt1基因可能參與器官的形成。Ecdmrt2基因在初孵仔魚期表達水平最高，而 Ecdmrt2b在器官形成期表達量達到峰值，推測Ecdmrt2b基因可能參與器官形成，而 Ecdmrt2基因可能參與仔魚生長發育。Ecdmrt3基因在初孵仔魚表達量達到峰值，推測 Ecdmrt3基因可能參與石斑魚仔魚的生長發育。Ecdmrt 基因家族在進化過程中，功能出現了歧化。Ecdmrt 基因家族在斜帶石斑魚的胚胎發育過程中，可能參與器官的形成以及仔魚的發育。