內源乳化法制備亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊及其環境響應性

楊安源，胡恩燁，周紅軍，周新華，舒緒剛

（仲愷農業工程學院化學化工學院/廣東省普通高校農用綠色精細化學品重點實驗室，廣東 廣州 510225）

【研究意義】 補硒對動物機體功能的發揮和預防部分疾病具有重要意義[1]，通過攝入適量的硒營養劑，可以有效預防缺硒疾病[2]。價廉易得的亞硒酸鈉是目前被廣泛使用的飼用硒營養劑。但亞硒酸鈉的營養劑量與毒性劑量間范圍較窄[3]，過量攝入易引起中毒[4]。同時，由于亞硒酸鈉穩定性欠佳，在一定條件下能與飼料中的營養物質反應[5]，導致硒元素流失，影響飼料品質及其營養價值。此外，在動物吸收亞硒酸鈉的過程中，硒元素主要經由腸道吸收，而胃部幾乎不吸收[6]。但在胃酸環境中，亞硒酸鈉氧化性有所增強[7]，能與胃部還原性物質如維生素C（Vc）作用，導致Vc失效，而且影響腸道對硒元素的吸收[8]，產物隨糞便排出，對環境造成潛在污染。因此需要通過技術手段提高亞硒酸鈉在環境中的穩定性，并使亞硒酸鈉營養劑兼具胃腸道響應性能，這對控制亞硒酸鈉在飼料中的用量、提高亞硒酸鈉的生物利用率、促進飼料中其他營養物質吸收乃至促進維持禽畜機體健康均有意義。

【前人研究進展】 目前研究者主要通過改善亞硒酸鈉的穩定性來提高亞硒酸鈉的生物利用率。Grilli等[9]通過噴霧冷卻法對亞硒酸鈉進行微膠囊化，亞硒酸鈉微膠囊化后硒元素轉移到牛奶中的效率高于直接使用亞硒酸鈉。但該法僅就亞硒酸鈉微膠囊化的生物利用率展開討論，且工序繁瑣。而響應性微膠囊兼具改善物質穩定性和特異性響應的特點，可作為提高亞硒酸鈉生物利用率的新途徑。響應性微膠囊已在智能控釋、靶向給藥、病蟲防治等領域[10-12]得到廣泛應用。響應性微膠囊的響應性主要受控于其溶脹行為[13-14]，而微膠囊的溶脹行為與其成囊壁材特性和環境因素密切相關。其中，海藻酸鈉是一種具有“酸沉堿溶”特性的微膠囊壁材，可作為腸溶性響應微膠囊的壁材。Chang等[15]制備了具有pH響應的海藻酸鈉微膠囊，但該法所用的高碘酸等試劑存在一定的安全隱患，且制備過程復雜。同時，微膠囊的溶脹行為可借助溶脹動力學模型對其進行分析。前人通過探究溶脹數據的關系，提出了不同的溶脹動力學模型[16-21]。Zhao等[22]對滸苔水凝膠的整個溶脹行為進行了Schott溶脹動力學模擬，Schott動力學模型能有效描述滸苔水凝膠的溶脹過程。【本研究切入點】 內源乳化法海藻酸鈉微膠囊具有操作簡便、設備簡單的特點，易于對藥物進行包埋。而藥物微膠囊響應性釋放藥物的能力與微膠囊的溶脹性能密切相關[23]。我們在前期研究了亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊（SSSAMC）的制備工藝，并對其進行傅里葉紅外和X射線衍射等分析[24]的基礎上進一步深入研究，著重研究微膠囊的溶脹性能，以明確亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊的溶脹動力學，這將對其響應特性及其腸道給藥具有指導意義。

【擬解決的關鍵問題】 為提高亞硒酸鈉在飼料中的生物利用率，促進維持禽畜機體健康，降低亞硒酸鈉過量使用對環境造成的污染，本研究采用內源乳化法制備 SSSAMC。通過初步探討SSSAMC在不同環境條件下的溶脹動力學，分析亞硒酸鈉/微膠囊的響應性，為后續實現微膠囊的腸胃響應及動物試驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海藻酸鈉（Sodium alginate，SA，化學純），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；98%亞硒酸鈉,購自西亞化學試劑廠；納米碳酸鈣（Nano-CaCO3，化學純），≤19 μm，購自佛山市源磊粉體有限公司；Span 80（化學純），購自天津市福晨化學試劑廠；冰醋酸（分析純），購自國藥集團化學試劑有限公司；液體石蠟（化學純）、無水乙醇（分析純），購自天津富宇精細化工有限公司；硫代硫酸鈉、碘化鉀（分析純），購自廣州光華化學試劑廠。

主要試驗儀器有S4800型掃描電子顯微鏡（SEM，日本Hitachi Limited公司）、TGA2型熱重分析儀（TGA，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 SSSAMC的制備

稱取1.8 g SA與0.9 g Nano-CaCO3于燒杯中，加入100 mL去離子水，攪拌過夜，作為水相備用。量取150 mL液體石蠟于燒杯中，向液體石蠟中加入2 %(W/W) Span 80與0.6 g Na2SeO3，乳化30 min，作為油相。取50 mL水相滴加到油相中，持續攪拌90 min，形成W/O型乳液。然后緩慢加入2 mL冰醋酸，持續攪拌40 min。凝膠化、過濾后用無水乙醇洗滌至試樣表面不出現油層，75 ℃干燥12 h，常溫真空干燥24 h。空白微膠囊（SAMC），除不加Na2SeO3外，其他步驟依照SSSAMC制備方法。

1.3 SSSAMC的結構表征

采用熱重分析儀，分別對Na2SeO3、SAMC和SSSAMC進行熱重分析，升溫范圍40～950 ℃，升溫速率10 ℃/min，N2流量50 mL/min；采用掃描電子顯微鏡分別對Na2SeO3、SAMC和SSSAMC進行形貌觀察，電壓3.0 kV。同時，對SAMC和SSSAMC進行能譜掃描（EDS），分析微膠囊中的C、Ca、O、Se含量。

1.4 SSSAMC的溶脹性能分析

1.4.1 pH對SSSAMC溶脹性能的影響 準確稱取0.5 g SSSAMC置于濾紙袋中，分別置于30 ℃蒸餾水中，用HCl或NaOH調節pH值為1、7、13，每隔一段時間取出濾紙袋，用濾紙迅速吸干樣品表面水分，稱重，3次重復。

1.4.2 溫度對SSSAMC溶脹性能的影響 準確稱取0.5 g SSSAMC置于濾紙袋中，分別置于pH為7的蒸餾水中，調節蒸餾水溫為30、50 ℃，保持取出樣品時間點與1.4.1相同，用濾紙迅速吸干樣品表面水分，稱重，3次重復。

1.4.3 離子強度對SSSAMC溶脹性能的影響 準確稱取0.5 g SSSAMC置于濾紙袋中，分別置于pH 7、溫度30 ℃的蒸餾水中，用NaCl調節溶液濃度為0、0.3、0.5 mol/L，保持取出樣品時間點與1.4.1相同，用濾紙迅速吸干樣品表面水分，稱重，3次重復。

繪制SSSAMC溶脹率SR（Swelling Ratio）與時間的關系曲線，作為SSSAMC的溶脹動力學曲線。SR按下式計算：

式中，mt為t時刻時微膠囊的質量（g），m0為初始時刻微膠囊的質量（g）。

1.5 SSSAMC的溶脹動力學研究

溶脹動力學探究微膠囊/凝膠的溶脹隨時間變化的關系，是微膠囊智能化的重要特征。本研究制備的SSSAMC為三維立體凝膠網絡結構，為了更合理地描述微膠囊溶脹過程，采用Schott模型研究其溶脹動力學。Schott動力學模型表達式如下：

將上述方程重新整理得到Schott的另一種形式：

式中，m0為干燥的SSSAMC質量（g），mt為t時刻SSSAMC的質量（g），Qt為t時刻SSSAMC的溶脹度（g/g），Q∞為SSSAMC的理論溶脹度（g/g），Kis為SSSAMC初始溶脹速率常數〔g/（g·min）〕。

將t/Qt對t作圖可得到一條斜率為1/Q∞、截距為1/KisQ∞2的直線。

2 結果與分析

2.1 SSSAMC的熱穩定性分析

從Na2SeO3、SAMC和SSSAMC的熱穩定性（TG）結果（圖1）可知，SAMC在40～200 ℃間SAMC失重約16.2%，由SAMC失去游離水、內部結合水以及部分分子內部糖苷鍵斷裂分解所致。在200～400 ℃間SAMC失重61.6%，此過程中SAMC內SA分子內糖苷鍵繼續斷裂分解，相鄰的羥基以水分子形式脫除，羧基產生CO2脫除。在600～800℃間SAMC失重11.2%，最終產物為CaO。Na2SeO3在460～540 ℃間失重2.8%，在700～950 ℃失重10.5%，殘余84.8%。對比三者的DTG（TG的一次微分曲線）可知，Na2SeO3在460 ℃以下具有良好的熱穩定性。而SAMC和SSSAMC在測試溫度范圍內失重特性相似，說明包埋Na2SeO3未改變SA結構。由于SSSAMC中含有Na2SeO3，致使SAMC和SSSAMC最終失重率出現差異，兩者最終失重率分別為93.8和86.8%，SSSAMC較SAMC失重率減少7%。

圖1 Na2SeO3、SAMC和SSSAMC的熱穩定性結果Fig.1 Thermostability spectra of Na2SeO3,SAMC and SSSAMC

2.2 SSAMC的掃描電鏡及能譜分析

Na2SeO3、SAMC和SSSAMC的掃描電鏡（SEM）結果如圖2所示。由圖2A可知，Na2SeO3粒徑為50～120 μm，形貌為規則長方體顆粒，表面光滑。結合我們前期工作的XRD分析結果[24]可知，此為Na2SeO3晶體。由圖2B可知，SAMC粒徑為5～40 μm，形貌規則，為球型，表面大部分區域光滑，有少量凹陷出現。由圖2C可知，SSSAMC粒徑為10～35 μm，整體為規則球狀，球狀表面有不連續凸起的顆粒，且有少量凹陷和氣孔出現，且SSSAMC表面為無規則的長方體顆粒。對比SAMC的形貌以及結合FTIR分析可知，SSSAMC表面不連續凸起的顆粒是Na2SeO3，成因可能是Na2SeO3與SA液滴接觸后溶解，少部分SeO32-在滲透壓的推動下滲透至SA液滴內部。SA液滴與Ca2+交聯固化后，在微膠囊干燥過程中殘留在微膠囊表面的Na+或Ca2+與SeO32-重新形成Na2SeO3或CaSeO3。該結果與SSSAMC樣品在XRD分析中強衍射峰消失現象結果相符合。

從SAMC和SSSAMC的能譜（EDS）分析結果（圖2）可知，SAMC表面含有C、O和Ca 3種元素，其含量分別為48.183%、46.767%和5.050%（圖2D）。SSSAMC表面含有C、O、Ca和Se 4種元素，其含量分別為35.612%、50.116%、18.259%和5.151%（圖2E）,表明Na2SeO3已成功包埋至SSSAMC中。

圖2 Na2SeO3、SAMC和SSSAMC的掃描電鏡（SEM）和能譜（EDS）分析結果Fig.2 Scanning electron microsope (SEM) photos and energy spectrum(EDS) of Na2SeO3, SAMC and SSSAMC

2.3 SSSAMC的響應特性及溶脹動力學

2.3.1 pH對SSSAMC溶脹動力學的影響 圖3A是SSSAMC分別在pH為1、7、13時的溶脹曲線。由圖3A可知，SSSAMC的平衡溶脹率隨溶液pH的增大而增大，說明SSSAMC的溶脹具有pH響應性。SSSAMC在pH 13時，其平衡溶脹率由在pH 1時的45.0%提高到86.4%。SSSAMC的pH響應性能受-COOH的離子化程度控制，在酸性或中性溶液中，羧基僅有少量-COOH離子化，SA分子鏈未能在溶液中自由舒展，SSSAMC的吸水空間受到限制，其溶脹行為受酸性和中性溶液pH值的影響有限；在堿性溶液中，羧基離子化程度大大提高，增大SA分子間的靜電斥力；同時Na+通過離子移變作用置換了部分已絡合的Ca2+，造成SSSAMC網絡結構松弛，使得SSSAMC的孔隙增大，可增強其吸水能力、提高其平衡溶脹率。

SSSAMC在不同pH下的溶脹動力學擬合情況如圖3B和表1所示。動力學擬合相關系數R2為0.99以上，變量t與t/Qt呈線性相關，說明SSSAMC在不同pH下的溶脹行為符合Schott模型。SSSAMC的初始溶脹速率常數Kis隨溶液pH增大由 0.398 g/（g· min）降至 0.049 g/（g·min），而理論平衡溶脹度Q∞隨pH增大由0.456 g/g增至0.904 g/g。SSSAMC在酸性環境中，H+促進SA中的-COOH質子化，促使微膠囊內部形成分子內和分子間氫鍵，引起微膠囊中SA分子收縮，而降低SSSAMC溶脹度。同時，由于酸的加入，提升了溶液的滲透壓，提高了SSSAMC中的溶脹速率。而SSSAMC于堿性環境中，-OH抑制SA中的-COOH質子化，SA分子間靜電斥力作用下，擴展了SSSAMC中三維網絡孔徑，使SSSAMC更具吸水性，而增加SSSAMC的溶脹度。同時，堿性環境中的Na+進入微膠囊內部，提高微膠囊內部滲透壓，導致SSSAMC在堿性環境中溶脹速率下降。

圖3 pH對SSSAMC溶脹性能的影響（A）及溶脹動力學t/Qt-t曲線（B）Fig.3 Effect of different pH on the swelling properties of SSSAMC（A）and the swelling kinetics t/Qt-t curves（B）

表1 不同pH溶液中SSSAMC溶脹動力學方程和動力學參數Table 1 Swelling kinetic equations and kinetic parameters of SSSAMC in solution with different pH

2.3.2 溫度對SSSAMC溶脹動力學的影響 圖4A是SSSAMC分別在溫度為30、50 ℃時的溶脹曲線。由圖4A可知，SSSAMC的溶脹速率隨溶液溫度增大，平衡溶脹率隨之增大，說明SSSAMC的溶脹具有溫度響應性。SSSAMC在溶液溫度為50 ℃時，其平衡溶脹率由30 ℃時的67.0%提高到91.0%。升高溶液溫度，一方面減弱了SSSAMC分子鏈間和SA分子與水間的氫鍵作用，降低了SSSAMC結構的緊密程度，使SA的分子鏈可充分舒展；另一方面可使SSSAMC和水分子的動能增大，水分子更易進入SSSAMC內部。因而SSSAMC在溶脹過程中具有溫度響應性。

SSSAMC在不同溫度下的溶脹動力學擬合情況如圖4B和表2所示。動力學擬合相關系數R2為0.99以上，變量t與t/Qt呈線性相關，說明SSSAMC在不同溫度下的溶脹行為符合Schott模型。SSSAMC的初始溶脹速率常數Kis隨溶液pH增大由 0.218 g/(g·min)降至 0.087 g/(g·min)，而理論平衡溶脹度Q∞隨pH增大由0.677 g/g增至0.904 g/g。理論平衡溶脹度與實驗平衡溶脹度相近。

表2 不同溫度溶液中SSSAMC溶脹動力學方程和動力學參數Table 2 Swelling kinetic equations and kinetic parameters of SSSAMC in solution with different temperature

圖4 溫度對SSSAMC溶脹性能的影響（A）及溶脹動力學t/Qt-t曲線（B）Fig.4 Effect of different temperature on the swelling properties of SSSAMC（A）and the swelling kinetics t/Qt-t curves（B）

2.3.3 離子強度對SSSAMC溶脹動力學的影響 圖5A是SSSAMC分別在NaCl濃度為0、0.3、0.5 mol/L時的溶脹曲線。由圖5A可知，SSSAMC的溶脹速率隨NaCl濃度增大而增大，平衡溶脹率隨濃度增大而降低，說明SSSAMC的溶脹具有離子強度響應性。SSSAMC的離子強度響應性主要受Na+對其結構破壞程度與電荷屏蔽作用控制。當NaCl濃度較低時，Na+對其結構破壞程度是SSSAMC離子濃度響應的主導因素，Na+滲透至微膠囊內部與海藻酸鈣中的Ca2+發生交換，破壞微膠囊的“蛋盒”（egg-box）結構，微膠囊結構變得疏松，有利于水分子進入微膠囊內部[25]。然而，隨著鹽溶液NaCl濃度的增加，Na+對-COO-的電荷屏蔽作用增加，在SSSAMC離子響應中逐漸占主導地位。高濃度的NaCl溶液增強了Na+對-COO-的電荷屏蔽作用，導致SAMC分子鏈間的靜電斥力減少，從而抑制了海藻酸鈉中分子鏈的舒展[26]。對比實驗數據可知，Na+對-COO-的電荷屏蔽作用是導致SSSAMC在高鹽濃度下溶脹度下降的主導因素。

SSSAMC在不同離子濃度下的溶脹動力學擬合情況如圖5B和表3所示。動力學擬合相關系數R2為0.99以上，變量t與t/Qt呈線性相關，說明SSSAMC在不同離子濃度下的溶脹行為符合Schott模型。SSSAMC的初始膨脹率受凝膠網絡結構和溶脹介質與SSSAMC間的滲透壓影響[27]。隨著溶液鹽濃度增大，鹽溶液與SSSAMC間的滲透壓增大，在高滲透壓推動下，提高水分子和Na+進出SSSAMC的速率。然而，大量Na+進入SSSAMC后加劇了Na+對-COO-的電荷屏蔽作用，抑制了SSSAMC中SA分子鏈的舒展。同時，由于鹽溶液與SSSAMC間存在滲透壓，為達到滲透平衡，部分進入SSSAMC的水分重新回到鹽溶液中，因而降低了SSSAMC的溶脹度。

圖5 離子強度對SSSAMC溶脹性能的影響（A）及溶脹動力學t/Qt-t曲線（B）Fig.5 Effect of different ion concentration on the swelling properties of SSSAMC（A）and the swelling kinetics t/Qt-t curves（B）

表3 不同離子強度溶液中SSSAMC溶脹動力學方程和動力學參數Table 3 Swelling kinetic equations and kinetic parameters of SSSAMC in solution with differention concentration

3 討論

本研究針對Na2SeO3作為飼用硒營養劑使用時存在穩定性欠佳的問題，采用內源乳化法制備了SSSAMC，其中Na2SeO3為芯材、SA為壁材。對SSSAMC進行了熱穩定性、結構表征、能譜及其環境響應性分析。SSSAMC具有較好的熱穩定性，且形貌規整，其中硒元素含量約為5%。SSSAMC的溶脹能力是其環境響應性的重要考察對象。Gasmi等[23]以酮基布洛芬（Ketoprofen）為模型藥物，PLGA〔Poly（D, L lactic-co-glycolic acid）〕為壁材，制備了PLGA微粒，考察PLGA微粒溶脹與藥物緩釋間的關系。結果表明，PLGA微粒溶脹在藥物釋放控制中起決定性作用。因而，通過探討SSSAMC在不同的pH、溫度以及離子濃度下的溶脹性能，考察SSSAMC的環境響應能力，對實現長效保護和腸道釋放Na2SeO3具有指導意義。而SSSAMC的溶脹性能及其環境響應能力與SA的性質和結構密切關系。SA作為本研究制備微膠囊使用的壁材，其具有能在堿性環境中溶解卻不溶于酸性條件的特點，可以作為一種口服腸道給藥載體。由樣品的SEM分析可知，SSSAMC表面分布著不同直徑的孔隙，這種結構促進了其溶脹過程中的物質交換。Lin等[28]研究中也有類似討論，他們認為水凝膠的響應性溶脹不僅受水凝膠基質性質的影響，同時受到水凝膠的結構影響。此外，溶脹介質的分子動能、滲透壓和電荷屏蔽作用等外部因素均會對SSSAMC的溶脹能力產生不同程度的影響。溶液介質中分子動能增大能促進SSSAMC的溶脹，而溶脹介質的滲透壓和電荷屏蔽作用增大，對SSSAMC的溶脹起到抑制作用。SSSAMC在本試驗pH下的平衡溶脹率為45.0%～86.4%，在本試驗溫度下的平衡溶脹率為67.0%～91.0%，在本試驗離子濃度下的平衡溶脹率為31.2%～67.8%。可見，SSSAMC兼具pH、溫度和離子強度響應性，有望作為一種長效保護和腸道釋放亞硒酸鈉的飼用硒營養劑。對SSSAMC的溶脹數據進行數學模擬，能更便捷地描述SSSAMC的溶脹過程及響應性能。王飛鏑等[29]將大豆蛋白（SPI）經預熱處理、EDTAD酰化和戊二醛交聯，制備出改性大豆蛋白凝膠，并探究了化學改性大豆蛋白改性凝膠溶脹規律，對該凝膠溶脹過程進行Fick模型擬合，得到了較好的線性相關系數，但該溶脹模型使用范圍僅在0＜Mt/M∞≤0.6間（Mt為t時刻凝膠所吸收水分的質量；M∞為溶脹平衡時凝膠中吸收水分的質量），其未能完整描述凝膠的整個溶脹過程。Ibrahim等[30]通過自由基聚合制備了丙烯酸、丙烯酰胺和N, N-二甲基丙烯酰胺水凝膠，采用Schott模型對水凝膠的整個溶脹過程進行了擬合，得到了較滿意的擬合結果。Schott模型可視為一種用于探究三維水凝膠溶脹過程的動力學模型。SSAMC的整個溶脹過程經Schott模型擬合，其線性相關系數均達0.99以上。同時，各條件下的理論溶脹度與實驗測得的微膠囊溶脹度接近，表明Schott模型能有效描述SSSAMC的溶脹過程及環境響應性。

4 結論

本研究分別以Na2SeO3、SA和Nona-CaCO3作為芯材、壁材和交聯劑，采用內源乳化法制備了SSSAMC。通過分析SSSAMC的熱穩定性、形貌與表面元素含量以及在不同pH、溫度和離子濃度下的溶脹能力，考察其結構特征與環境響應特性。結果表明，SSSAMC具有較好的熱穩定性，且形貌規整，其表面硒元素含量約為5%。在SSSAMC制備過程中，微膠囊表面形成孔隙有利于SSSAMC進行物質交換，而Na2SeO3則以無定型的形式包埋與海藻酸鈉微膠囊內。同時，SSSAMC兼具pH、溫度和離子濃度響應性，其溶脹行為符合Schott模型，其相關系數達到0.99以上。SSSAMC具備作為腸道響應釋放亞硒酸鈉的應用潛力。