抗根腫病甘藍型油菜新種質的創制及抗性評價

2019-05-14 11:16:26羅延青王云月趙德勝趙凱琴周丕才符明聯董云松李勁峰王敬喬

西南農業學報 2019年4期

羅延青，王云月, 趙德勝, 趙凱琴, 周丕才, 符明聯, 董云松, 李勁峰,王敬喬*

(1.云南農業大學植物保護學院，云南昆明 650201；2.云南省農業科學院經濟作物研究所，云南昆明 650205；3.楚雄州農業科學院經濟作物研究所，云南楚雄 675000)

【研究意義】根腫病是發生在十字花科作物上的一種植物病害，在全球范圍內廣泛發生，對具有重要經濟價值的蕓薹屬作物如白菜、甘藍和油菜等危害嚴重[1]。根腫病由蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)引起的，感病植株根部會形成大小不一的根瘤，阻礙植物所需水分和營養物質的吸收和運輸，導致植株地上部分出現葉片變黃、植株矮小及萎蔫等癥狀，嚴重感病時可導致植株死亡[2]。灌溉、農事操作中農機具混雜使用和附著在種子表面的休眠孢子是根腫病害傳播和擴散的主要渠道[3]。近年來，根腫病害在四川、重慶、湖南、浙江、廣西等省(市)發生危害日益嚴重，對十字花科作物造成了重大損失，根腫病防控已成為十字花科作物種植中亟待解決的問題[4-6]。嚴位中等2004年對云南省根腫病發病情況系統調查發現，全省10個地州(市)均有根腫病的發生[7]。目前，根腫病害已蔓延到全省各油菜主產區，并對油菜生產造成不同程度的損失，嚴重影響油菜產業的發展[8]。如何有效地控制根腫病的危害和蔓延，是云南省油菜產業發展中亟需解決的難題。【前人研究進展】目前，根腫病主要通過與非十字花科作物輪作或間作、土壤酸堿度的調節、以及使用化學殺菌劑等方法來進行防控[9-10]。根腫病菌的休眠孢子在土壤中能存活多年，適宜條件下就能萌發侵染寄主，導致輪作或間作收效甚微[11]；生產上多采用百菌清、氟啶胺等化學藥劑，對根腫病能起到一定的防控效果，但存在生產成本較高以及環境污染等問題[12]。因此，選育根腫病抗病品種是最為經濟有效的防控措施[3]。國內外通過研究已獲得許多對根腫病表現抗性的種質材料。歐洲飼料蕪菁中許多品種如Siloga，Milan White等對根腫病具有抗性，并已應用選育出大白菜抗病品種[13]；此外，Williams鑒別系統和歐洲根腫病鑒別系統中的鑒別寄主對根腫病菌存在抗、感性反應差異，具有生理小種專化抗性，這些材料也可用于根腫病抗性育種[14]。根腫病菌具有生理小種的分化，且存在致病性變異，不同地區的根腫病菌生理小種不同。季海雯等對甘藍型油菜根腫病病菌進行鑒定，發現有2，4和13號，其中4號小種分布范圍最廣[6]。沈向群等對遼寧、山東、云南、四川和吉林等5省15個發病區域的根腫病病原菌進行生理小種鑒定，共分別發現2，4，7，10和11號生理小種，云南的為4號生理小種[15]。劉峰等對云南和西藏的根腫病樣品進行鑒定，共鑒定出10個生理小種，其中4號生理小種為優勢種[16]。丁云花等對云南、湖北、重慶、四川等8個省(市)采集的18份病樣進行鑒定，共鑒定到2，4和7號生理小種，在云南鑒定到2號和4號，主要以4號生理小種為主[17]。【本研究切入點】根腫病抗性育種中已選育出一批抗性白菜、油菜品種，但由于所用的抗性親本材料不同，以及各地區生理小種間的差異，抗性株系僅在一定區域內表現出抗病性；由于云南自身的氣候特點，通過引種來進行根腫病防控具有一定的局限性。因此，抗病育種必須針對當地特定的病原生理小種選擇合適的親本[18]。對云南特定的根腫病生理小種，韓國選育的大白菜品種 “康根51”(俗稱白菜王)在云南各種植區或對云南采集的病菌表現出較強的抗病性，可作為云南根腫病抗病育種的抗源材料[7,19]。因此，本研究中擬以“康根51”作為抗性親本，以種間雜交的方式將“康根51”的抗性引入到甘藍型油菜中，以期創制獲得抗(耐)根腫病甘藍型油菜新種質。【擬解決的關鍵問題】創制獲得對云南特定根腫病生理小種表現抗性的甘藍型油菜新種質，為油菜根腫病抗病育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

“康根51”為韓國選育的大白菜根腫病抗病品種，10P002、10P005、10159等為云南省農業科學院經濟作物研究所創制獲得的甘藍型油菜種質，為根腫病感病材料。

1.2 方法

1.2.1 種質創制過程以“康根51”為父本，甘藍型油菜為母本通過人工去雄授粉的方式進行雜交獲得F1代種子。室內根腫病抗性初篩后，將未發病植株移栽并套袋或與原甘藍型油菜親本進行回交獲得雜交后代材料，依此進行后種植于大田，單株自交套袋收種，選擇結實率較好的用于抗性鑒定試驗，共計663份。

1.2.2 染色體數目觀察以抗性親本大白菜 “康根51”、甘藍型油菜10159以及雜交獲得的不同世代種子萌發后的根尖為材料進行染色體數目的觀察與計數。采用壓片法制備染色體標本[20]。選取籽粒飽滿的種子，鋪放在帶有2層濾紙的滅菌培養皿中，加入少量滅菌ddH2O潤濕濾紙，并于培養箱中25 ℃暗培養60 h。切下約1 cm 左右的根尖部分，放入0.002 M 8-羥基喹啉中，15 ℃ 40 r/min搖床處理3 h。用清水清洗根尖2～3次，并加入卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸/3∶1)，4 ℃過夜。取根尖放入1 M HCl中，60 ℃水浴中水解10 min。清水洗凈后，取白色根尖部分在載玻片上，壓平根尖，并加入卡寶品紅工作液進行染色，10 min后在顯微鏡下觀察、計數及拍照。染色體數目的確認以觀察30個細胞以上，85 %以上的細胞具有一致的染色體數目，即可認為是最終染色體數目。

1.2.3 分子驗證采用經篩選獲得的在親本材料間存在差異的2對SSR引物，對構建的抗性種質進行PCR分析，引物為Ra2-A11(5’-GACCTATTTTAATATGCTGTTTTACG-3’和5’-ACCTCACCG-GAGA GAAATCC-3’)和Na10-D09(5’-AACGTCAAGATCCTCTGC-3’和5’-ACCACCACGGTAGTAGAGCG-3’)。PCR反應體系為15 μl，分別為1×PCR緩沖液，2.5 m mol/L MgCl2，正反向引物各20 ng，0.2 m mol/L dNTPs，1UTaq酶，20 ng DNA模板。反應條件為94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共計35個循環。2.5 %的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.4 大田抗性篩選選擇昆明茨壩和小哨2個多年種植白菜且根腫病嚴重發病的田塊進行抗性評價。每份材料設3個重復，并以“康根51”和甘藍型油菜“花油8號”(記為H8)(云南省農業科學院經濟作物研究所選育的品種)為抗、感病對照，每20份材料設1組對照，在苗期進行病害調查與統計。

1.2.5 室內抗性鑒定對大田抗性初篩后獲得的抗性種質進行室內接種驗證。以楚雄州東瓜鎮油菜發病根瘤上分離的休眠孢子為病源。休眠孢子按照常規方法稍作修改后進行提取[21]。采用菌土接種法進行接種，具體操作如下：土壤121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻拌勻后重復滅菌1次。土壤稱重后進行拌土，使其休眠孢子的密度為5×107～ 1×108個/g土，pH值調節在5.4 ～ 6.5。帶菌土壤裝入穴盤中，每盤中播種10粒種子，于人工氣候箱中進行培養，溫度設定為26 ℃。每個材料設3個重復，并以“康根51”和“H8”為抗、感病對照。出苗40 d后，澆足水將植株完整拔出，清洗根部后進行發病統計調查。

1.2.6 病害等級劃分標準病情等級劃分標準參考Siemens等[22]的方法進行。分為5個級別，0級：根部無癥狀；1 級：側根有腫塊，主根無腫塊；2級：主根有腫塊，側根無腫塊；3級：主、側根均有腫塊；4級：主、側根有大量嚴重腫塊。

1.2.7 病情指數計算和抗性評估標準病情指數(disease index，DI)計算公式如下：

抗性評估標準：050，高感(high susceptibility,HS)。

1.2.8 數據統計分析采用SPSS對發病率和病情指數進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 染色體數目分析

以“康根51”為父本，甘藍型油菜純系材料為母本進行雜交創制獲得了種間雜交后代材料。為鑒定創制獲得的植株是否為真實雜種，以親本材料“康根51”、10159及其構建的不同世代雜交后代暗培養后的根尖為材料進行染色體數目分析。分析結果顯示“康根51”染色體數目為20條(圖1A)，10159染色體數目為38條 (圖1B)，與理論值相符。甘、白雜交F1代的染色體數目為29條(圖1C)，具有與預期相符的染色體數目。進一步分析發現，F3的染色體數目為32條(圖1D)，BC2的染色體數目為35條(圖1E)。隨著世代的增加，染色體數目逐漸趨于正常，在BC4和F4中均發現含有38條染色體及自交結實正常的甘藍型油菜單株。以上結果表明獲得的種質確為以“康根51”為親本創制的。

2.2 雜交后代分子檢驗

為進一步驗證創制獲得的新種質為甘、白雜交的后代材料，采用經篩選獲得的在“康根51”和10159中存在差異的SSR標記對創制的種質進行PCR擴增。引物Na10-D09擴增結果顯示雙親存在差異，它在“康根51”中擴增到一條大小在250 bp左右的清晰條帶，而甘藍型油菜10159除擴增到該條帶外，還具有其它兩條清晰條帶，F2單株的擴增結果除具有與“康根51”相同的條帶外，與親本10159完全相同，不能由此判定它們是“康根51”和10159的雜交后代；引物Ra2-A11在親本間存在差異，且F2單株具有雙親共同帶型，這表明所創制的種質確為甘、白種間雜交后代(圖2)。

2.3 大田抗性篩選

分別在昆明茨壩和小哨2個根腫病發病嚴重的田塊對663份材料在苗期進行病害調查統計。在自然發病條件下，“康根51”基本不發病，H8發病率平均為30.61 %，最高可達56.3 %，供試的663份材料發病率在0～85.5 %(數據未顯示)。綜合2個點的病害調查結果，2點6個重復中均未發病或發病率較低的材料共有29份(表1)。其中R072等10份種質為F3代材料，R179等17份種質為F4代材料，R384等2份材料為BC1F2代材料。

圖1 親本及不同雜交世代染色體數目分析Fig.1 Numbers of chromosome of parents and different generations

2.4 室內抗性鑒定

采用菌土接種法對大田初篩獲得的29份種質進行根腫病抗性鑒定。在人工接種條件下，對照H8發病率為86.7 %，病情指數為64.17，為高感品種。抗性親本“康根51”發病率為6.7 %，病情指數為5.00，表現為高抗。10P002、10159等甘藍型油菜純系親本材料的發病率在26.7 %～83.3 %，平均發病率為50.43 %，病情指數分別為26.67～70.00，除10P005對篩選所用的根腫病生理小種表現為抗病外，其余皆表現為感病或高感(表1)。

經室內接種驗證，29份雜交后代材料中2份材料R150和R322，分別為F3和F4代種質，對楚雄東瓜分離的根腫病生理小種表現為高抗，發病率分別為6.7 %和13.3 %，病情指數分別為5.83和7.50；R072 、R087等19份F3、F4和BC1F2世代材料表現為抗病，發病率在13.3 %～36.7 %，病情指數在10.83～25.80；R085等4份F3和F4代種質材料表現為感病，發病率在30.0 %～66.7 %，病情指數在30.00～45.80；R225等4份F3和F4代種質材料表現為高感，發病率在70.0 %～83.3 %，病情指數在50.83～79.70。

2.5 發病率與病情指數相關性分析

采用SPSS軟件對“康根51”與甘藍型油菜純系親本以及其雜交后代材料的根腫病病情指數與發病率進行相關性分析，發病率與病情指數呈極顯著正相關(P<0.01，表2)。在圖3中，病情指數隨發病率的增加而增加，相關公式為y=0.805x+0.556，決定系數R2=0.916。虛線矩形內的為高抗品種(種質)，虛線橢圓形內的為高感品種(種質)。

M：DL2000；1：“康根51”，2：10159，3～7：F2單株M：DL2000；1：‘CR51’，2：10159，3-7：F2plant圖2 SSR引物在親本和F2單株PCR擴增結果Fig.2 The PCR amplification results of SSR primers in parent and F2generation

表1 油菜種間雜交后代根腫病抗性表現

表2 病情指數與發病率相關性分析

2.6 抗(耐)根腫病甘藍型油菜新種質的創制

以“康根51”為父本，甘藍型油菜純系材料為母本進行雜交獲得的F1代植株自交結實率較低，經回交或多代自交后獲得的種質材料結實趨于正常，田間表型性狀與甘藍型油菜基本一致。通過染色體數目和分子驗證，確實為甘、白雜交后代材料。田間抗性鑒定和室內抗性接種驗證，共創制獲得2份根腫病高抗種質，19份表現為抗病。

3 討論

在根腫病抗性研究中，對現有種質資源以及收集的抗病品種和資源進行抗性評價對根腫病抗病育種具有重要作用。為此，國內開展了大量的根腫病抗性鑒定研究工作。四川主栽油菜品種和引進的德國甘藍型油菜對成都根腫病發病嚴重區的抗性鑒定中發現，低感品種僅占15.22 %，無抗病品種[4]。陳靜等采用室內外抗性鑒定相結合對79份甘藍新組合進行抗性鑒定，篩選到對重慶市涪陵區根腫病病菌表現高抗的GZ78，有助于培育具有地區特征性的抗性品種[23]。黃曉莉等通過田間自然誘發鑒定、溫室和組織培養室內人工接種鑒定等 3 種方法對50個白菜品種進行抗性評價，3種方法的鑒定結果存在差異，其中7個品種經3種鑒定方式均表現為高抗，可以在病區種植[24]。

通過“康根51”與甘藍型油菜進行雜交，創制了663份甘、白雜交后代材料。經茨壩和小哨2個點的田間抗性初篩獲得29份抗性較好的種質，進一步進行室內接種鑒定，共21份表現為抗病，其中R150和R322表現為高抗。田間抗性鑒定的結果與室內抗性結果有差異，造成這種差異的原因可能如下：①田間鑒定受氣候、土壤環境和其它病原微生物的影響，且存在根腫病菌分布和數量不均等因素，在不同田塊和年度間抗性鑒定結果可重復性稍差；室內抗性鑒定的土壤酸堿度、光照、溫度等因素可調控，植株的出苗整齊并且可重復性高，但植物的生長發育與自然條件下存在差異。因此2種方法的鑒定結果會存在不同。②根腫病菌生理小種存在致病性分化，田間的生理小種可能是以復合形式存在的，較室內采用單個根瘤擴繁并分離休眠孢子進行接種而言，田間的鑒定環境更為復雜。田間鑒定更接近于自然條件下根腫病的發生、致病過程，具有生產上的應用價值，單一的任何一種抗性鑒定方法都不能完全真實的反應種質抗病性。因此，對種質材料的抗性鑒定評價宜采取田間抗性鑒定和室內抗性鑒定相結合的方法，才能較為準確的進行抗病性評價。

圖3 親本及雜交后代病情指數與發病率關系Fig.3 Relationship between disease index and disease incidence of parents and hybrid offspring

對染色體數目的分析表明，在白菜和甘藍型油菜雜交過程中染色體發生了置換，白菜的染色體或染色體的大片段置換到了甘藍型油菜中。在研究過程中雜交后代結實率較差，究其原因可能一是“康根51”存在自交不親和現象，二是染色體數目異常。此外，采用在親本間存在差異的引物進行檢測，發現雜交后代具有雙親的互補帶型，為“康根51”和甘藍型油菜親本雜交創制獲得的種質。

根腫病菌生理小種是以鑒別寄主接種病菌后的抗、感病性進行劃分的[6,14]，對云南不同地區采集的根腫病樣生理小種鑒定表明，云南省存在多種生理小種，其中4號小種為優勢種。 “康根51”在云南省的根腫病發病區域具有較好的根腫病抗性，但在室內抗性鑒定中發現，少數植株的根部有微小根瘤，可能為雜合體單株抗性相對較弱。由于田間的病原體是以復合形式存在的，因此要獲得在生產上真正具有應用價值的品種，應采用基因聚合的方式將多個外源抗性基因導入到同一種質中，可篩選獲得具有多個生理小種抗性的新種質。