利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)構(gòu)建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T細胞株

覃鴻妮，謝鈺珍，馬 傲，蔡一林

(1. 蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院,江蘇 蘇州 215123；2.金唯智生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215123；3. 西南大學(xué)玉米研究所，重慶 400716)

【研究意義】三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette, ABC)超家族含有1個三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒，可通過利用ATP水解過程釋放的能量在溶質(zhì)中跨膜轉(zhuǎn)運各種生物分子[1]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白在腦組織中膽固醇的膜外轉(zhuǎn)運和維持穩(wěn)態(tài)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。細胞內(nèi)膽固醇主要通過SR-BI介導(dǎo)的雙向轉(zhuǎn)運模式，主動擴散以及由ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的膽固醇單向跨膜轉(zhuǎn)運機制排出胞外[2-3]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)域和氨基酸同源性可分為ABCA～ABCG亞家族7個亞家族，人類基因組共包含48個具有轉(zhuǎn)錄活性的ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運子基因。ABCG1和ABCG4均為ABC 轉(zhuǎn)運體超家族的成員。【前人研究進展】研究表明，ABCG1基因可廣泛表達于各種人和巨噬細胞及小鼠組織中，能有效調(diào)節(jié)神經(jīng)膽固醇的流動。Northern印跡分析顯示人ABCG4 mRNA僅在大腦和眼睛的神經(jīng)視網(wǎng)膜中高度表達，且ABCG4和ABCG1共有74 %的氨基酸序列同源性，所以ABCG4也可以促進膽固醇流向高密度脂蛋白(HDL)。目前關(guān)于ABCG1和ABCG4的功能研究還存在諸多問題，例如，對于ABCG1在動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病過程中的確切作用機制仍存在爭議；ABC家族成員之間的相互作用關(guān)系仍有待進一步研究；動物模型的實驗結(jié)果應(yīng)用于人時存在一定的局限性；ABCG4轉(zhuǎn)運子在腦細胞的特殊定位和功能分析，特別是ABCG4轉(zhuǎn)運子在腦脂質(zhì)動態(tài)平衡與神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的功能還有待進一步闡明[4]。2012 年起 CRISPR/Cas9 被改造為基因編輯工具，可高效、便捷地完成基因定點突變、片段的敲除或敲入等[5-6]。【本研究切入點】CRISPR/Cpf1系統(tǒng)是在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)的一種新型基因編輯技術(shù)。Cpf1相對于Cas9具有更高的特異性，比CRISPR/Cas9更適用于精確的基因組編輯，因此其在疾病模型建立、抗癌藥物研制、干細胞治療等生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。如何將CRISPR/Cpf1技術(shù)應(yīng)用于疾病治療，以及由此引發(fā)的安全性和倫理問題，也都需要更加深入的研究和規(guī)則的制定加以解決[7-9]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用CRISPR/Cpf1基因組編輯技術(shù)，建立成熟的CRISPR/Cpf1基因敲除系統(tǒng)，為同類或其他基因的敲除提供借鑒；通過實現(xiàn)對細胞中ABCG1和ABCG4基因敲除模型的建立，為進一步研究細胞中膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用提供幫助，從而加快相關(guān)的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用研究的進展。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞株(293T)購于協(xié)和大學(xué) (美國) 細胞庫，Crispr/Cpf1質(zhì)粒， Ascpf1和Lbcpf1載、Top10感受態(tài)細胞由金唯智生物科技有限公司構(gòu)建；5×pfu buffer(通用)、10×pfu buffer(通用)、1×稀釋 buffer、PBS、pfu DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4連接酶均由由蘇州金唯智公司試劑組配制；BsmB1(ESP31)限制性內(nèi)切酶購自thermo公司；T7E1限制性核酸內(nèi)切酶購自北京唯尚立德公司；FBS(胎牛血清)購自BI(Biological Industrics)公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自HYClone公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒均購自AXYGEN公司；細胞基因組DNA抽提試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA引物的設(shè)計與合成 使用NCBI數(shù)據(jù)庫下載ABCG1和ABCG4基因組完整序列,使用CRISPR在線設(shè)計工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)，分別在ABCG1和ABCG4蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS區(qū))前7個外顯子設(shè)計sgRNA，根據(jù)網(wǎng)站設(shè)計的結(jié)果，選取2對得分較高的序列，在其兩端加上酶切位點，在每條sgRNA序列的F鏈5’端添加AAAA，R鏈的5’端添加AGAT, 目的是與AsCpf1/LbCpf1質(zhì)粒在BsmB1(ESP31)酶切后形成的黏性末端互補(表1)。引物序列由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 載體的構(gòu)建及鑒定 AsCpf1/LbCpf1載體為含U6啟動子(啟動SgRNA)表達載體，其本身可以表達Cpf1酶，并具有卡那青霉素和嘌呤霉素篩選抗性。將ABCG1和ABCG4的2對sgRNA寡核苷酸單鏈分別退火合成雙鏈，用T4連接酶和BsmB1(ESP31)限制性內(nèi)切酶將退火后的引物通過邊切邊連的方法連接到AsCpf1/LbCpf1載體,構(gòu)建AsCpf1-ABCG1-sgRNA1、LbCpf1-ABCG1-sgRNA2、AsCpf1-ABCG4-sgRNA1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA2重組質(zhì)粒；取連接產(chǎn)物10 μl轉(zhuǎn)化至Top10 F’感受態(tài)細胞中，在Kan抗性的LB平板上篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒并送進位置生物科技有限公司測序，使用LkO-5(GACTATCATATGCTTACCGT)通用引物測序。

表1 ABCG1和ABCG4的sgRNA寡核苷酸序列

注：黑色加粗字體表示在序列兩端添加的堿基。

Note：The black bold font indicates the base added at both ends of the sequence.

1.2.3 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染 提前將10 % FBS DMEM于水浴鍋中37 ℃水浴10 min左右，293T細胞用1 mL培養(yǎng)基重懸，加入10 cm培養(yǎng)皿中，補10 mL DMEM培養(yǎng)基于5 % CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)。細胞傳兩代后，進行計數(shù)，待細胞長到85 %以上進行鋪板。細胞轉(zhuǎn)染前24 h，進行計數(shù)按照一定比例鋪6孔板。選擇形態(tài)規(guī)則、融合度約在70 %～80 %的細胞，進行PEI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒(3000 ng)與PEI(2000 ng/mL)按3∶1的比例加入2 mL EP管，孵育5 min后，加入到NaCI和PEI的混合液中，混勻后靜置20 min，轉(zhuǎn)染293T細胞于5 % CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6 h后，用PBS或0.9 % NaCl清洗一次，培養(yǎng)基換成含10 % FBS培養(yǎng)細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染效率，選取轉(zhuǎn)染效率高的且形態(tài)規(guī)則的細胞進行加嘌呤霉素處理(終濃度20 μg/mL), 24～48 h后用0.9 % NaCl清洗換液，10 %FBS含雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.2.4 靶位點編輯效率驗證 轉(zhuǎn)染72 h后提取細胞基因組DNA，通過PCR擴增目的細胞基因組以得到目的DNA片段，回收PCR產(chǎn)物，采用T7E1核酸內(nèi)切酶酶切回收后的AsCpf1-ABCG1-sgRNA1、LbCpf1-ABCG1-sgRNA2、AsCpf1-ABCG4-sgRNA1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA2 DNA條帶片段，使用3 %的瓊脂糖凝膠檢測DNA 片段，目的片段測序驗證sgRNA編輯效率。

1.2.5 篩選穩(wěn)定細胞株 轉(zhuǎn)染96 h后，觀察細胞生長狀況并計數(shù)，采用有限稀釋法按每孔5～6個細胞稀釋到96孔板中，培養(yǎng)5～7 d后，在顯微鏡下觀察96孔板中的細群落的個數(shù)，并做好記錄。細胞生長到一定階段會發(fā)生細胞堆積，根據(jù)細胞生長情況選取“單細胞”的96孔，可消化后緩慢吹打孔中的細胞，使細胞密度均勻，有利于加速細胞增殖的速度。5～7 d后，選取其中狀態(tài)較好且已長滿的96孔的單細胞系，經(jīng)過消化后，取出一部分細胞液，剩余細胞液添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取出的細胞12 000 r/min 離心2 min，移去上清，PBS清洗1次，加入1×PCR稀釋液裂解細胞2 U，蛋白酶K消化產(chǎn)物中蛋白，95 ℃ 5 min后，取5～10 μl作為巢式PCR擴增的模板。

1.2.6 單克隆細胞系驗證 單克隆細胞基因組擴增產(chǎn)物切膠純化后雙向測序。對測序結(jié)果進行分析，選擇正確有編輯的結(jié)果分別將其對應(yīng)的PCR產(chǎn)物進行TA克隆，每個選取30個陽性克隆送測序。觀察PCR產(chǎn)物TA克隆測序結(jié)果是否存在雙克隆，如果存在需將雙克隆菌液劃線培養(yǎng)，挑斑并選取10個孔菌液送測，以進一步確定是否為單克隆細胞。根據(jù)測序結(jié)果，選取移碼的突變細胞株轉(zhuǎn)入6孔細胞培養(yǎng)皿進行擴大培養(yǎng)后抽提基因組，再次進行PCR擴增和產(chǎn)物純化測序，確定為只含兩種峰型的突變細胞株，將驗證后的細胞轉(zhuǎn)移到10 cm細胞皿擴大培養(yǎng)，待細胞長滿后進行凍存。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的測序

重組質(zhì)粒AsCpf1-ABCG1-sgRNA1、LbCpf1-ABCG1-sgRNA2、AsCpf1-ABCG4-sgRNA1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA2的測序結(jié)果顯示，在靶位點插入的片段位置、方向及序列與預(yù)期結(jié)果一致，證明ABCG1和ABCG4的sgRNA插入到AsCpf1/LbCpf1載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2～5)。

圖1 CRISPR/Cpf1-sgRNA載體圖譜Fig.1 CRISPR/Cpf1-sgRNA vector

圖2 AsCpf1-ABCG1-sgRNA1靶位點測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of target sites of AsCpf1-ABCG1-sgRNA1

圖3 LbCpf1-ABCG1-sgRNA2靶位點測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of LbCpf1-ABCG1-sgRNA2 target sites

圖4 AsCpf1-ABCG4-sgRNA1靶位點測序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of target sites of AsCpf1-ABCG4-sgRNA1

圖5 LbCpf1-ABCG4-sgRNA2靶位點測序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of LbCpf1-ABCG4-sgRNA2 target sites

2.2 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞，48 h后，熒光顯微鏡下觀察4組293T細胞都有綠色熒光蛋白表達(圖6)，對比白光下的細胞對比明顯較少。

2.3 sgRNA靶向敲除效率T7E1酶切驗證

轉(zhuǎn)染72 h后提取細胞基因組DNA，通過PCR擴增目的細胞基因組以得到目的DNA片段，AsCpf1-ABCG4-sgRNA 1細胞基因組沒有擴增出來，其他3個靶位點均擴增出了目的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)過T7E1酶切后，通過反顯圖可以看出產(chǎn)生明顯的掉帶，AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1和LbCpf1-ABCG1-sgRNA 2掉帶大小均為667 bp，AsCpf1-ABCG4-sgRNA 1掉落2個分別為220和447 bp的條帶；LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2掉帶大小均為642 bp，LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2掉落2個分別為156和486 bp的條帶(圖7)，表明3個sgRNA靶向敲除效率均較高。將T7E1酶切驗證有編輯效率的3個靶位點對應(yīng)的PCR產(chǎn)物測序進一步驗證，表明AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1、LbCpf1-ABCG1-sgRNA 2和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2測序產(chǎn)物完全正確且均靶位點處有明顯套峰，說明3個靶位點編輯成功。

2.4 穩(wěn)定細胞株構(gòu)建

將編輯后的細胞采用有限稀釋法每孔4～5個分到96孔培養(yǎng)皿中，篩選并標(biāo)記單克隆細胞(圖8)，對篩選結(jié)果進行統(tǒng)計分析，AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1一共篩出10個單克隆細胞，LbCpf1-ABCG1-sgRNA 2一共篩出17個單克隆細胞，LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2一共篩出8個單克隆細胞。

A：AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1；B：LbCpf1-ABCG1-sgRNA 2；C：AsCpf1-ABCG4-sgRNA 1；D：AsCpf1-ABCG4-sgRNA 1圖6 293T細胞熒光蛋白表達Fig.6 Fluorescent protein expression in 293T cells

Lane1：AsCpf1-1-g1產(chǎn)物+H2O；Lane2：AsCpf1-1-g1產(chǎn)物+T7E1酶；Lane3：LbCpf1-1-g2產(chǎn)物+H2O；Lane4：LbCpf1-1-g2產(chǎn)物+T7E1酶；Lane5：LbCpf1-4-g2產(chǎn)物+H2O；Lane6：LbCpf1-4-g2產(chǎn)物+7E1酶；LaneM：Marker DS5000圖7 sgRNA靶向敲除效率Fig.7 Targeted knockout efficiency of sgRNA

A-單細胞在白光視野下(4×)；B-單細胞在白光視野下(10×)A-single cell under white light (4×) and B-single cell under white light (10×)圖8 單克隆細胞Fig.8 Monoclonal cells

2.5 單克隆細胞系編輯效率驗證

單細胞系巢式PCR擴增送測，測序結(jié)果表明AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1有編輯效率的有4個，LbCpf1-ABCG1-sgRNA 2有編輯效率的有3個，LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2有編輯效率的有1個。將有編輯效率的細胞基因組PCR擴增產(chǎn)物進行TA克隆，挑取30個陽性克隆測序驗證，其中5個單細胞系均在兩套峰型以上，確定為雙克隆細胞株，只有3個具有一套或兩套峰型：

AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1為單一的兩套峰型，一套缺失7個堿基GACCTGC,一套缺失34個堿基ACATGGAGGCCACTGAGACGGACCTGCTGAATGG(圖9)，是純合的單克隆細胞株；AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-2不是單一的兩套峰型，一套缺失21個堿基GAGGCCACTGAGACGGACCTG，一套缺失25個堿基TGAGACCTGCTGAATGGACATCTGA(圖10)，有雙克隆需進一步策序驗證；LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1僅為單一的一套峰型，缺失1個G堿基，突變7個堿基CGGCAGG(圖11)，是一個純合的單克隆細胞株。

圖9 AsCpf1-ABCG1-g1-1 TA克隆測序結(jié)果Fig.9 Cloning and sequencing results of AsCpf1-ABCG1-g1-1TA

圖10 AsCpf1-ABCG1-g1-2 TA克隆測序結(jié)果Fig.10 Cloning and sequencing results of AsCpf1-ABCG1-g1-2TA

2.6 雙克隆細胞系編輯效率驗證

將AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-2測序菌液XM504劃線培養(yǎng)，選取10個孔菌液送測，分析其測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了有兩套目的峰型外，還有3個雙克隆(圖12)。通過對其峰型進行分析發(fā)現(xiàn)，雙克隆的套峰是由GGCCACACGG和GGACATCTGA兩種峰型雜合形成的，與兩套目的峰型的結(jié)果一致，確定為雙克隆細胞株。

2.7 單克隆細胞株測序作最終效率驗證

根據(jù)TA克隆測序結(jié)果，選取移碼的突變細胞株轉(zhuǎn)入6孔細胞培養(yǎng)皿進行擴大培養(yǎng)后抽提基因組，再次進行PCR擴增和產(chǎn)物純化并測序，通過分析比對靶位點附近的堿基序列及峰型，AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1在靶位點處的套峰是由TGTCCAGCA和CGTGAATGG兩種峰型雜合形成的，與TA克隆測序的結(jié)果一致，是一個純合的單克隆細胞株(圖13)；AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-2在靶位點處的套峰是由GGCCACACGG和GGACATCTGA兩種峰型雜合形成的，與TA克隆測序的結(jié)果一致，為只含兩種突變類型的突變細胞株(圖14)，結(jié)合TA克隆和終驗證測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶位點后面有單個堿基的隨機突變，不是穩(wěn)定的單克隆細胞；LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1靶位點處僅為1個堿基缺失，7個堿基突變(CGGCAGG)的單一峰型，是一個純合的單克隆細胞株(圖15)。

圖11 AsCpf1-ABCG4-g2-1 TA克隆測序結(jié)果Fig.11 Cloning and sequencing results of AsCpf1-ABCG4-g2-1TA

圖12 AsCpf1-ABCG1-g1-2 雙克隆測序驗證Fig.12 Verification of AsCpf1-ABCG1-g1-2 biclonal sequencing

圖13 AsCpf1-ABCG1-g1-1終驗證Fig.13 Verification of AsCpf1-ABCG1-g1-1

圖14 AsCpf1-ABCG1-g1-2終驗證Fig.14 Verification of AsCpf1-ABCG1-g1-2

圖15 AsCpf1-ABCG4-g2-1終驗證Fig.15 Verification of AsCpf1-ABCG4-g2-1

3 討 論

2012年，Jinek等證實了Cas9 可以在體外條件下與DNA 靶序列的特定位點結(jié)合并進行剪切，由此揭開了將CRISPR/Cas9 改造為基因編輯工具的序幕。近5 年來，CRISPR/Cas9技術(shù)為生物領(lǐng)域帶來了巨大的沖擊，2013 年被Science 雜志評為十大科學(xué)突破之一，2015 年更是榮登榜首。然而，隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas9暴露了它的缺陷和局限性，例如嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。如何改造CRISPR/Cas9，降低其脫靶效應(yīng)，提高基因編輯精確度，是目前科學(xué)家們關(guān)注和研究的重點[5]。

CRISPR/Cpf1 是繼CRISPR/Cas9后，2015 年報道的一種新型CRISPR 效應(yīng)蛋白，利用人工設(shè)計的sgRNA介導(dǎo)外源表達的Cpf1蛋白與基因組靶點特異性結(jié)合以實現(xiàn)對基因組DNA 的特異性切割，切割后的基因組DNA通過非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HDR)的方式進行修復(fù)，NHEJ是真核細胞中斷裂DNA主要的修復(fù)方式，在修復(fù)的過程中會在斷裂DNA鏈中隨機的插入或缺失不定數(shù)目的堿基,通過基因移碼突變來實現(xiàn)目的基因功能的缺失。CRISPR/Cpf1有利于克服CRISPR/Cas9 應(yīng)用中的一些限制，作為新一代的CRISPR 基因組編輯工具，對CRISPR/Cpf1的研究才剛剛開始，有許多發(fā)展、改造和利用的空間[10]。

本研究一方面通過摸索條件，建立成熟的CRISPR/Cpf1基因敲除系統(tǒng)，為同類或其他基因的敲除提供借鑒。為了保證此次實驗篩選的細胞為有編輯的單克隆細胞，在篩選的前期過程中，加入了嘌呤霉素大量殺死沒有轉(zhuǎn)染成功的細胞以提高細胞的編輯效率，在篩選后期過程中，對TA克隆測序中可能存在的雙克隆細胞，進行雙克隆菌液劃線培養(yǎng)后進一步測序驗證；另一方面，繼CRISPR/Cpf1出現(xiàn)兩年以來，各國研究組先后利用CRISPR/Cpf1 完成了對少數(shù)微生物、植物和動物基因組的編輯，目前還尚未有ABCG1/ABCG4基因采用CRISPR/Cpf1技術(shù)敲除的研究報道，ABCG1和ABCG4基因能夠直接或間接的調(diào)控細胞中膽固醇代謝，深入研究其在膽固醇代謝中具體調(diào)節(jié)作用，將有助于了解一系列固醇類疾病的發(fā)病機制，并為此類疾病的防治提供新的方向與方法。本研究構(gòu)建的目的細胞ABCG1/ABCG4基因敲除的細胞系，是深入研究ABCG1和ABCG4基因功能的前提基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過利用新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，利用人工設(shè)計的sgRNA介導(dǎo)外源表達的Cpf1蛋白與基因組靶點ABCG1和ABCG4特異性結(jié)合，通過基因移碼突變來實現(xiàn)目的基因功能的缺失，永久性敲除了目的細胞靶基因，獲得敲除ABCG1和ABCG4基因的穩(wěn)定細胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。穩(wěn)定的基因敲除細胞株可直接用于后續(xù)研究，為進一步探索和證實ABCG1和ABCG4在細胞中膽固醇代謝和調(diào)節(jié)作用提供幫助，加快相關(guān)的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用研究的進展，同時建立了成熟的CRISPR/Cpf1基因敲除系統(tǒng)，可為同類或其他基因的敲除提供借鑒。