加拿大蓬揮發油通過模擬揮發和淋溶途徑對豌豆保衛細胞的毒性效應及機制

王 煜，肖 楊，熊正偉，唐 雪，唐小燕，胡 莉

(1.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610101；2.四川師范大學細胞生物學研究室，四川 成都 610101)

【研究意義】外來入侵植物加拿大蓬(Erigeroncanadensis)[1]對周圍農作物生長的抑制效應已經引起了研究者們的廣泛重視[2-4]。如2003年Shaukat等[5]發現加拿大蓬不同濃度水浸提液可顯著抑制番茄(LycopersiconesculentumMill.)、蘿卜(RaphanussativusL.)玉米(ZeawaysL.)等6種作物種子的萌發及其根、芽的生長。高興祥等[6]于2010年證實加拿大蓬全株水浸提物、莖葉淋溶物、根系分泌物及殘體土壤分解物等均可顯著抑制多種受體植物種子萌發和幼苗生長。楊莉等[7]發現多種作物的種子萌發和根、芽的生長受到加拿大蓬揮發油經揮發和淋溶途徑的化感脅迫作用。這些研究主要集中于對加拿大蓬的對受體物種植株水平上不同化感脅迫效應的現象揭示，但就該現象的本質及其在細胞水平、分子水平上作用機制的研究卻罕有報道。【前人研究進展】本研究室張紅等[8]的前期研究發現，加拿大蓬揮發油經空氣和土壤載體均可使蠶豆(VaciafabaL.)根尖細胞產生多種類型的染色體畸變，誘導微核產生，顯著抑制了幼根的生長。其后的相關研究表明[9]，加拿大蓬揮發油可誘導受體植物根邊緣細胞死亡，從而抑制了受體植物根系的生長發育。此外，植物葉片下表皮的氣孔保衛細胞也能對環境脅迫做出極為靈敏的反應[10]，可以用于評價環境毒物對細胞的致死、致突變、致畸形等效應[11-13],是研究外來入侵植物產生的化感物質作用機制的良好材料。【本研究切入點】目前，加拿大蓬揮發油通過揮發、淋溶途徑對周圍受體植物氣孔保衛細胞的毒性作用尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】因此，本文擬采用受到加拿大蓬入侵危害的作物豌豆(Pisumsativum)葉片下表皮保衛細胞為受體材料，模擬揮發和淋溶兩途徑研究了加拿大蓬揮發油的毒性效應，并用多種抑制劑進行干擾處理，旨在明確加拿大蓬揮發油通過不同途徑對豌豆保衛細胞的遺傳毒害和致死效應，以期為揭示其入侵的分子機制提供相應的理論依據，并可為加拿大蓬的有效防治以及合理開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

加拿大蓬采自四川師范大學成龍校區內，豌豆種子為市售。

泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK及6種干擾劑均產自Beyotime生化試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 材料的培養和準備 采用水蒸氣蒸餾法[]提取加拿大蓬揮發油，所提取的揮發油為淺黃色透明液體，有刺鼻性氣味，收集到的揮發油用無水硫酸鈉干燥后得液體揮發油，使用二甲基亞砜(DMSO)為助溶劑，配制成10 %的揮發油母液，置4 ℃冰箱保存備用。

挑選顆粒飽滿、無損傷的豌豆種子，蒸餾水漂洗3次，0.5 % KMnO4消毒8 min，蒸餾水洗凈，25 ℃暗培養24 h，換濕紗布包裹催芽2～3 d。選取萌發狀況一致的種子均勻種植于盛有營養土的花盆中(直徑14 cm，高度12 cm)，每隔3 d澆1次水。3～4周取平展葉片用于實驗。

1.2.2 脅迫處理 挑選高度一致、葉片大小均勻、長勢良好、無損傷的豌豆苗，從豌豆苗頂端取完全伸展開的葉片，用鑷子在葉片上撕取長1～1.5 cm，寬0.5～1.0 cm的表皮條放入加有5 mL MES緩沖液[12]的EP管中。① 模擬揮發途徑的化感脅迫處理：將表皮條平鋪于濾紙條(8 cm × 0.9 cm)上，放入加有1 mL MES緩沖液的10 mL EP管內，使濾紙條浸于MES緩沖液中，分別在EP管蓋上均勻涂抹揮發油母液1、2、4、8、16 μl，以僅MES緩沖液處理為CK，25 ℃光照培養箱中處理0.5 h，重復3次;② 模擬淋溶途徑的化感脅迫處理:分別取揮發油母液1、2、4、8、16 μl(記為梯度1、2、3、4、5)，DMSO補至16 μl后加入EP管中，25 ℃光照0.5 h，以僅MES緩沖液(CK1)和MES緩沖液加16 μl DMSO處理(CK2)為對照，重復3次。

1.2.3 緩解處理 在1.2.2的EP管中分別加入下列干擾劑：抗氧化劑AsA(0.5 mmol/L)100、200、400 μl，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)清除劑CAT(500 U/mL)20、40、80 μl，Ca2+螯合劑EGTA(0.5 mmol/L)40、80、160 μl，Ca2+通道抑制劑LaCl3(0.5 mmol/L)20、40、80 μl，硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)抑制劑NaN3(0.5 mmol/L)20、40、80 μl，一氧化氮合酶(Nitric oxide synthetase，NOS)抑制劑L-NAME(0.5 mmol/L)15、30、45 μl，泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(0.1 μmol/L)10、20、40 μl，預處理10 min后分別按① 和② 加入8 μl揮發油母液，以只加MES緩沖液(CK1)和MES緩沖液附加8 μl揮發油母液(CK2)為對照，重復3次。

1.2.4 細胞核形態和細胞活性檢測 核形態檢測：表皮條經MES緩沖液清洗后，卡諾氏液固定2 h，1 mol/L鹽酸60 ℃解離8 min，蒸餾水洗3次，Schiff試劑避光染色1 h，LEICA DM300顯微鏡下觀察拍照。每處理至少觀察1000個細胞，計算核異常率。

細胞活性檢測：采用馬丹煒等[15]的方法稍有改進。表皮條經MES緩沖液洗3次后鋪于載玻片上，AO/EB避光染色3 min，LEICA DM300熒光顯微鏡(徠卡顯微系統公司)觀察拍照。具亮紅色熒光為死細胞，綠色熒光為活細胞。每處理至少觀察1000個細胞，計算死亡率。

a:正常活細胞；b:單保衛細胞失活；c:雙保衛細胞失活；d:核斷裂和畸形；e:核固縮、遷移和畸形；f:核斷裂和消失a: Normal living cells; b: Single guard cell inactivation; c: Double guard cell inactivation; d: Nuclear fracture and deformity; e: Nuclear condensation, migration and deformity; f: Nuclear breakage and disappearance圖1 加拿大蓬揮發油處理后豌豆保衛細胞活性變化Fig.1 Viability changes in the guard cells ofPisum sativumexposed to volatile oil fromErigeron canadensis

1.3 數據統計與分析

數據錄入和作圖采用Microsoft Excel 2010，SPSS 20.00統計分析軟件對數據進行單因素方差分析、Duncan法比較均值，獨立樣本T檢驗結合隸屬函數法[16]比較兩條途徑下揮發油毒性效應的強度。隸屬函數計算公式為：

物流設施主要就是指為了能夠更好的開展物流工作而設置的系統以及組織等，其主要包括了物流信息管理系統、配送系統以及自動化立體倉庫等諸多基礎設施，在物流行業中占據著十分重要的地位。物流設備主要就是指為了能夠滿足物流生產作業而形成的必要操作工具，主要包括了搬運車、貨架、升降機以及集裝輔助件等諸多設備。

式中，U(Xi)為某處理下某指標的隸屬函數值；Xi為某處理水平的某指標測定值；Xmin和Xmax分別為所有參試系中該指標的最小值和最大值。先求出不同揮發油劑量處理下的各指標隸屬函數值后，求得每一指標的隸屬函數均值，最后得出不同途徑中各指標隸屬函數的總平均值。

2 結果與分析

2.1 加拿大蓬揮發油通過不同途徑對豌豆保衛細胞活性的影響

經AO/EB染色后，在熒光顯微鏡下，對照組豌豆保衛細胞大都能觀察到亮綠色存活狀態的細胞核(圖1a)，也有較少的保衛細胞細胞核出現死細胞的亮紅色熒光。無論揮發途徑還是淋溶途徑，處理組中均有較多紅色熒光的死亡細胞核(圖1b-f)，其數量具有隨揮發油處理劑量增加而上升的趨勢。同時也發現細胞核形態的大量畸變，如核畸形(圖1d-e)、核固縮和核遷移(圖1e)、核斷裂(圖1d，f)，甚至核降解消失(圖1f)等。其中細胞核固縮、斷裂、降解和消失等現象是植物細胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)的特征之一。這表明加拿大蓬揮發油經不同途徑對豌豆保衛細胞均具有明顯的細胞毒性，可誘導豌豆保衛細胞發生核形態的大量畸變，誘發細胞死亡，推測這種細胞死亡方式屬于程序性細胞死亡。

與對照組相比，加拿大蓬揮發油經不同途徑處理保衛細胞后，其死亡率均顯著增加(P<0.05，表1)，并隨著揮發油處理劑量的增加而顯著升高(Pearson揮發=0.924，Pearson淋溶=0.882，P<0.01)。當揮發油劑量為16 μl時，經揮發途徑處理后保衛細胞死亡率高達81.556 %，約為對照組的6倍；經淋溶途徑處理的細胞死亡率高于揮發途徑，達83.518 %。由此可見，加拿大蓬揮發油經揮發和淋溶途徑均可對豌豆保衛細胞產生明顯的細胞毒性，誘導保衛細胞死亡，并且具有劑量依賴效應。

當處理劑量相同時，加拿大蓬揮發油通過淋溶途徑處理組的死亡率均顯著高于揮發途徑處理組(P<0.05，表1)。同時，淋溶途徑處理下細胞死亡率的隸屬函數均值為0.600，高于揮發途徑的0.472。由此可見，在該模擬實驗條件下，加拿大蓬揮發油經淋溶途徑處理對豌豆保衛細胞的脅迫致死效應大于揮發途徑。

2.2 加拿大蓬揮發油通過不同途徑對豌豆保衛細胞細胞核形態的影響

在光學顯微鏡下觀察Schiff試劑染色后的豌豆保衛細胞，發現對照組中正常細胞核為著色較深的半月形，形態規則，左右對稱，位于保衛細胞中央(圖2a)。揮發油通過不同途徑處理后，豌豆保衛細胞的核形態常出現各種畸變，如核遷移(圖2b，d)、核固縮(圖2c，d，f)、核畸形(圖2b)、核降解消失(圖2d，e)等，且核畸變的發生率具有隨著揮發油處理劑量增加而升高的趨勢。

表1 加拿大蓬揮發油對豌豆保衛細胞活性和核形態的影響

注：小寫字母表示同一途徑不同劑量間的統計學差異；*表示揮發油劑量相同時，淋溶途徑與揮發途徑處理有顯著差異，P<0.05，下同。

Note: Lowercase letters indicate statistical differences between different doses of the same pathway; * indicates significant difference between the eluviation and volatilization treatment when the volatile oil dose is the same,P<0.05, the same as below.

表1數據顯示，加拿大蓬揮發油經2種途徑處理均可導致豌豆保衛細胞核畸變率顯著升高(P<0.05)，并隨著處理劑量增加呈先升高再降低的趨勢，細胞核畸變率均在揮發油劑量為8 μl時達到最大，隨后顯著下降(P<0.05)。在低劑量時，淋溶途徑細胞核畸變率顯著高于揮發途徑，當處理劑量分別為8和16 μl時反之(P<0.05)。由此可見，經不同途徑加拿大蓬揮發油處理的豌豆保衛細胞，無論處理劑量的多少，均可被誘導產生多種核畸變現象。

在劑量較低時(1、2、4 μl)，淋溶途徑處理下揮發油誘導的蠶豆保衛細胞核畸變率顯著大于揮發途徑(P<0.05)；劑量較高時(8、16 μl)反之。綜合分析顯示，淋溶途徑處理下核畸變率的隸屬函數均值為0.351，高于揮發途徑下的0.325。這表明加拿大蓬揮發油對于保衛細胞的遺傳毒性效應也具有淋溶途徑強于揮發途徑的特征。

a:CK；b：核遷移和畸形；c：核固縮和畸形；d：核遷移、固縮、降解；e：核降解消失；f：核固縮a: CK; b: Nuclear migration and aberration; c: Karyopyknosis and aberration; d: Nuclear migration, karyopyknosis and degradation; e: Nuclear degradation disappeared; f: Nuclear consolidation圖2 加拿大蓬揮發油作用下豌豆保衛細胞核形態的變化Fig.2 Changes in the nucleus morphology of guard cells inPisum sativumexposed to volatile oil fromErigeron canadensis

表2 AsA、CAT、EGTA、LaCl3、NaN3和L-name對加拿大蓬揮發油作用下細胞死亡的緩解效應

2.3 6種干擾劑對加拿大蓬揮發油致豌豆保衛細胞死亡的緩解效應

2.4 Z-VAD-FMK對加拿大蓬揮發油經不同途徑致豌豆保衛細胞死亡的緩解效應

Z-VAD-FMK(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone)是一種廣譜Caspase抑制劑，可抑制Caspase蛋白酶家族的活性，從而抑制Caspase依賴性細胞凋亡的發生[17]。經不同劑量泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK處理后，揮發油經不同途徑誘導的豌豆保衛死亡率均隨Z-VAD-FMK處理劑量的增加而降低(表3)。在兩條途徑中細胞死亡率均在Z-VAD-FMK劑量為40 μl時達最低水平。其中，揮發途徑細胞死亡率由66.215 %下降到10.892 %，顯著低于對照(P<0.05)；淋溶途徑細胞死亡率由73.512 %減少至19.637 %，與對照接近(P>0.05)。由此可見，Z-VAD-FMK能顯著抑制由加拿大蓬揮發油經不同途徑誘導的保衛細胞死亡，推測這種細胞死亡屬于Caspase樣蛋白酶激活引起的植物PCD現象。

3 討 論

3.1 加拿大蓬揮發油經不同途徑對豌豆保衛細胞的毒性效應

有研究表明[18-19]，入侵植物常可造成受體植物光合器官的損傷，降低其光合效率，從而抑制受體植株的生長發育。加拿大蓬也可導致玉米成熟植株葉面積減小，葉綠素a含量顯著降低，光合效率受到抑制[20]。結果證實，加拿大蓬揮發油對受體植物葉保衛細胞具有較強的遺傳致畸效應和細胞致死效應，與周健等[21]的研究結果一致。加拿大蓬揮發油通過揮發或淋溶途徑均可使保衛細胞產生遺傳損傷，誘發Caspase依賴性細胞凋亡，導致氣孔無法進行閉合調節。這很可能是入侵植物揮發性化感物質進入受體植物，對體內細胞進行化感攻擊的一個早期關鍵環節。推測進入植物體內的化感物質也可能通過類似方式，對光合器官以及營養、生殖器官造成毒性效應，影響受體植物的生理生化機能，最終表現為植株水平上的生長發育受阻、光合效率下降、作物產量降低等現象。

表3 泛 Caspase抑制劑對加拿大蓬揮發油作用下細胞死亡的緩解效應

3.2 經揮發和淋溶兩條途徑誘發的豌豆保衛細胞毒性效應差異

一般認為，入侵植物釋放的揮發性化感物質少部分通過淋溶進入土壤影響受體植物根系[22]，大部分則通過空氣或雨霧淋溶作用于受體植物的地上器官。由于加拿大蓬揮發油的主要成分均為難溶于水的萜類化合物及其氧化物、醇類、酚類以及酮類化合物等，因此在本研究的模擬條件下，利用DMSO進行了助溶，但數據顯示助溶劑對細胞死亡率和核畸變率的影響均不具有統計學意義。此外，加拿大蓬揮發油通過兩條途徑均可致使細胞活性下降，誘導細胞發生畸變。在同樣的處理劑量下，通過淋溶途徑作用于受體細胞時顯示出更強的毒性效應(淋溶途徑和揮發途徑下隸屬函數總平均值分別為0.475和0.398)，與張紅等[8]的研究結論相似。由于不同的途徑中作用于受體植物的化感物質有效濃度會因實驗方法的不同而產生較大差異，不同受體植物對不同途徑下化感脅迫的響應也有較大區別，因此關于化感途徑的相關研究還需要進一步開展下去。

3.3 ROS、NO和Ca2+參與加拿大蓬揮發油經不同途徑對豌豆保衛細胞的毒性效應

前人的研究表明[23]，植物體通過復雜的信號調控機制控制著細胞的各種生理功能，當植物遭遇內、外環境因子刺激時，ROS積累，作為信號分子進行信息的傳遞，觸發不同的信號響應途徑，可引發植物組織產生一系列的保護措施，如介導細胞發生程序性死亡等[24]。抗壞血酸(AsA)和過氧化氫酶(CAT)均能清除細胞內多余的活性氧[25-26]，二者分別顯著緩解了加拿大揮發油經兩種途徑誘導的細胞程序性死亡，表明ROS，特別是其中的H2O2，參與了該過程的信號調控。

在植物體抵抗外界刺激時，隨著ROS的爆發，NOS活性通常也隨之增強，使NO迅速積累[27]。由于植物體內的NR也是一種NOS[28]，因此，NR抑制劑NaN3和NOS抑制劑L-NAME均可抑制NO的產生。加拿大揮發油經兩種途徑誘導的保衛細胞死亡被NaN3或L-NAME顯著緩解，表明該過程不僅與ROS的積累有關，氣體信號分子NO也發揮著非常重要的調控作用。

王毅等[29]的研究表明，NO和ROS可通過Ca2+信號系統調控細胞程序性死亡來抵御外界刺激，NO的含量可影響胞內ROS和Ca2+的水平。積累的ROS可激活Ca2+通道，使胞外Ca2+內流而導致胞內Ca2+水平升高[30-31]。Ca2+螯合劑EGTA能夠降低細胞外Ca2+濃度從而阻止胞外Ca2+內流，Ca2+通道抑制劑LaCl3則能夠阻止外源Ca2+進入細胞。二者均可顯著抑制加拿大揮發油經兩種途徑誘導保衛細胞死亡，說明該過程還與胞內Ca2+的積累有關。由此推測，加拿大蓬揮發油的細胞毒性也可能是通過NO和ROS相互作用調節保衛細胞內Ca2+水平的變化而引起的。

4 結 論

加拿大蓬揮發油經揮發途徑和淋溶途徑均可誘導豌豆保衛細胞發生核畸變并大量死亡，且淋溶途徑的致畸致死效應較強。泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK和抗氧化劑AsA、CAT，Ca2+調節劑EGTA、LaCl3，NO抑制劑NaN3和L-NAME 6種干擾劑均可有效緩解揮發油誘導的保衛細胞死亡(P<0.05)，表明這種現象屬于Caspase依賴性的細胞凋亡，ROS、NO和Ca2+參與了這一過程的信號轉導調節。