一種新的黃瓜細菌性葉斑病拮抗細菌的篩選鑒定及其發酵條件的初步研究

穆曉雅，譚志瓊，劉 銅，彭正強，張榮意*

(1.熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室/海南大學熱帶農林學院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 海口 571101)

【研究意義】黃瓜(CucumissativusL.)葫蘆科黃瓜屬一年蔓生草本植物，是我國重要的栽培蔬菜之一。黃瓜生長周期長，易受各種病害累積量大，黃瓜細菌性病害時常發生。【前人研究進展】國內已報道由胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacteriumcarotovorumsub sp.brasiliense)引起的黃瓜細菌性軟腐病[1]、丁香假單胞菌流淚致病變種(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)引起的黃瓜細菌性角斑病[2]、野油菜黃單胞菌黃瓜致病變種(Xanthomonascampestrispv.cucurbitae)引起的黃瓜細菌性葉斑病[3]。由于黃瓜細菌性病害傳播速度快，如果病害發生會造成嚴重的損失。黃瓜作為中國南繁瓜菜科研育種的主要作物之一，各種黃瓜種植及育種在海南南繁區匯聚，而各種細菌性病害可以隨著種子傳播，使得南繁區域極易成為黃瓜細菌性病害的傳播和擴散的源頭，對南繁瓜菜科研育種的健康發展構成了潛在的威脅，甚至影響到全國黃瓜用種安全。【本研究切入點】本研究團隊在海南南繁區調查黃瓜病害時，發現了一種新的細菌性病害，一些品種發病率達90 %。論文“First Report of Bacterial Leaf Spot of Cucumber Caused byP.cichoriiin China” Plant Disease 已在線發表。目前化學藥劑防治是黃瓜細菌性病害的主要防治辦法，由于化學藥劑使用次數多，用藥量大，不僅使病原菌產生耐藥性，而且容易造成環境污染，對人類的健康以及其他生物生長均形成了一種潛在的威脅[4]。生物防治現成為人們研究的重點。許多生物制劑已經在防治中取得了顯著效果。由于黃瓜新的細菌性病害生防研究在國內外還未見報道，由此本文開展了對黃瓜新的病原菌菊苣假單胞的拮抗菌篩選鑒定的研究。【擬解決的關鍵問題】通過抑菌圈試驗篩選出對黃瓜葉斑病具有拮抗作用的菌株，通過形態學、生理生化測定、16S rDNA以及gyrA基因序列分析及構建系統發育樹對該拮抗細菌進行鑒定，最后對此拮抗細菌的發酵條件進行初步研究，為黃瓜一種新的葉斑病病原菌的生防制劑研發提供菌種資源，為有效控制黃瓜葉斑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤樣品從海南、安徽、浙江等地采集。供試病原菌為海南大學植病生防課題組分離、鑒定的黃瓜葉斑病病原菌菊苣假單胞(P.cichorii)。生理生化試驗對照菌株為海南大學植病生防課題組分離、鑒定的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。固體培養基為牛肉膏蛋白胨培養基[5](NA培養基)，液體培養基為不加瓊脂的NA。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌的分離與純化 采用《微生物學實驗》[6]中的操作方法分離、純化拮抗細菌。

1.2.2 拮抗菌抑菌效果測定 采用抑菌圈法[7]篩選具有拮抗作用的細菌：將培養24 h的黃瓜葉斑病病原菌菌液倒入熔融狀態下的NA培養基中(溫度55 ℃左右)。充分混均后倒平板，將之前分離出的的細菌接在上述帶菌平板上，3次重復。28 ℃培養，觀察是否有抑菌圈出現。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 (1)菌株的形態以及生理生化性狀測定。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[8]，對拮抗細菌的生理生化性狀進行測定，為保證試驗方法的準確性，對照菌株也一起進行測定。

(2)菌株16S rDNA序列測定以及系統發育樹的構建。用細菌DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA,16S rDNA的PCR擴增采用細菌通用引物:(27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[9]進行PCR擴增。PCR反應體系:2×PCR-Mixture 12.5 μl，引物各0.5 μl，總DNA 1 μl，dd H2O 10.5 μl，總體積25 μl。PCR的反應條件：預變性，94 ℃ 5 min；變性，94 ℃ 1 min；退火，50 ℃ 1 min；延伸，72 ℃ 1.5 min；30個循環后終止延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產物送華大基因公司測序。系統發育樹的構建：將測序結果在NCBI中進行BLAST比對，并通過MEGA6.0軟件進行系統發育樹的構建。系統發育樹構建方法采用Neighbor-join，自展數(Bootstrap)[10]為1000。

(3)菌株gyrA基因序列測定以及系統發育樹的構建。根據文獻[11]選擇高變異性蛋白酶促旋酶gyrA基因序列進行分析及構建系統發育樹。gyrA基因引物：(L100：5′-AAATCTGCCCGTATCGTCG-3′；R836：5′-GCGTCACGGCGRATCTCAA-3′)[12]。PCR反應體系同上。PCR的反應條件：預變性，94 ℃ 3 min；變性，94 ℃ 40 s；退火，61.7 ℃ 40 s；延伸，72 ℃ 25 s；30個循環后終止延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存。將PCR產物送到生工生物工程有限公司測序，將測序后的結果在NCBI中進行BLAST比對，并通過MEGA6.0軟件進行系統發育樹的構建。

1.2.4 拮抗菌發酵條件的研究 ①最適pH的測定。采用稀釋平板計數法[7]測定拮抗細菌的最適pH：配制pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11的NA培養基，將拮抗菌稀釋液涂布在不同pH的平板上。28 ℃培養，觀察平板上菌落數并記錄。②最適碳、氮源的測定。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[8]配制碳源、氮源基礎培養基，將拮抗菌接入上述培養液基，在28 ℃轉速為150 r/min的搖床中搖至48 h，采用紫外吸收比濁法[13](600 nm)測定吸光度，以不接菌的培養液為對照。③最適溫度的測定。將拮抗菌株接在NA培養液中，放在轉速為150 r/min溫度分別為20、25、30、35、40和45 ℃的搖床中，48 h后測定其吸光度，以不接菌的培養液為對照。④最適轉速的測定。將拮抗菌株接在NA培養液中，放在溫度為28 ℃轉速分別為90、120、150、180和220 r/min的搖床中，48 h后測定其吸光度，以不接菌的培養液為對照。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的分離與篩選

從采集的土壤中分離到650株細菌，以1種新的黃瓜葉斑病病原菌菊苣假單胞菌為目標菌株，通過抑菌圈法篩選得到10株具有拮抗作用的細菌，將其中具有較好拮抗效果的菌株編號為菌株JNL。

2.2 拮抗細菌的抑菌效果以及形態特征

從圖1可以看出，菌株JNL對黃瓜葉斑病病原菌菊苣假單胞具有拮抗作用。JNL菌落圓形，邊緣不整齊，半透明，質軟，易挑起。3 d后，菌落表面出現褶皺，質地硬，不透明，乳白色，不易挑起。

圖1 菌株JNL抑菌效果Fig.1 Bacterial effect of strain JNL

2.3 菌株生理生化特性

根據菌株形態特征以及表1的生理生化特性測定結果，對照《常見細菌系統鑒定手冊》，可以初步確定菌株JNL為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

16S rDNA及gyrA基因同源性分析。拮抗細菌的16S rDNA基因片段大小為1453 bp。在NCBI中進行BLAST比對，構建系統發育樹(圖2)，發現其與解淀粉芽孢桿菌在同一分支。將數據上傳至NCBI中，得到該菌株登錄號為MH588397。菌株JNLgyrA基因片段大小為713 bp，將數據上傳至NCBI中，得到登錄號為MH982189。用NCBI軟件比對、構建系統發育樹后，圖3顯示其與解淀粉芽孢桿菌在同一分支。綜合考慮菌株JNL的形態特征、生理生化特性、16S rDNA以及gyrA基因的比對結果。菌株JNL鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

表1 菌株JNL生理生化特性

注：表中“+”表示陽性，“-”表示陰性。

Note: ‘+’ indicates positive in the table and ‘-’ indicates negative.

圖2 菌株JNL基于16S rDNA基因構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the strain JNL based on 16S rDNA sequence

圖3 菌株JNL基于gyrA基因構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of the strain JNL based on genegyrAnucleotide sequences

2.4 拮抗菌發酵條件的分析

2.4.1 最適pH測定 由圖4可見，菌株JNL對酸堿環境有較強的適應能力，在pH 4.0～11.0的范圍內均可生長，在pH 5.0～9.0范圍內生長情況最好，最適pH為7.0。

圖中小寫字母不同表示差異顯著(P≤0.05)，下同The difference in lowercase letters in the figure indicates significant difference (P≤0.05),the same as below圖4 菌株JNL在不同pH下的生長情況Fig.4 Growth of strain JNL at different pH

2.4.2 最適碳源、氮源測定 由圖5～6可見，菌株JNL在碳源為葡糖糖、棉子糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖時,在氮源為脲、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀時均可生長，其中當氮源是氯化銨、硝酸銨時，不存在差異顯著性。其最適碳源為半乳糖，氮源為硝酸鉀。

圖5 菌株JNL在不同碳源下的生長情況Fig.5 Growth of strain JNL under different carbon sources

圖6 菌株JNL在不同氮源下的生長情況Fig.6 Growth of strain JNL under different nitrogen sources

2.4.3 最適溫度的測定 由圖7可見，菌株JNL最適生長溫度為30 ℃，在溫度下降或上升時，其生長效果均減弱。且不同溫度之間存在顯著性差異。

2.4.4 最適轉速的測定 由圖8可見，菌株JNL在轉速上升或者下降時，其生長效果均有所下降。其最佳轉速為150 r/min。且不同搖床轉速之間存在顯著性差異。

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，在形態學上很難對芽孢桿菌進行分類，因此屬種主要根據生理生化特性和16S rDNA序列分析進行鑒定，但是由于枯草芽孢桿菌近緣種群分類變化速度快，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)及暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)等。對該群菌株準確鑒定的難度越來越大，因此只有把傳統的方法與先進的分子生物學方法相結合，才能對該群菌株進行準確的鑒定[11]。本研究采用形態學觀察、生理生化特性測定與16S rDNA以及gyrA基因序列分析相結合的方法對枯草群進行了有效區分，最終將菌株JNL鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

芽孢桿菌內生芽孢，對不利環境適應力強，繁殖速度快，自然界中分布廣泛，并且是一類非致病細菌。解淀粉芽孢桿菌不僅可以通過分泌次生代謝產物(抑菌蛋白類、脂肽類抗生素、大環內酯類、寡肽酶、肽類和聚酮化合物等)來抑制病原菌的生長，還可通過誘導提高植株自身的抗病能力。解淀粉芽孢桿菌對植物病原細菌有顯著的防治效果，可以作為生物農藥來適當替代化學農藥使用[14]。

4 結 論

試驗從海南、安徽、浙江等地的土壤中分離出一株對新的黃瓜細菌性葉斑病的病原菌菊苣假單胞具有拮抗作用的菌株。通過形態學觀察、生理生化性狀測定、16S rDNA同源性序列分析以及gyrA基因序列分析，確定菌株JNL為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。通過單因子變量法測定菌株JNL在pH為7、溫度為30 ℃、碳源為半乳糖、氮源為硝酸鉀、轉速為150 r/min的條件下生長效果最好。

圖7 菌株JNL在不同溫度下的生長情況Fig.7 Growth of strain JNL at different temperatures

圖8 拮抗菌JNL在不同轉速下的生長情況Fig.8 Growth of antagonistic antibacterial JNL at different speeds

拮抗菌JNL對一種新的黃瓜細菌性葉斑病的病原菌菊苣假單胞具有拮抗作用。為微生物農藥開發奠定了菌源基礎，對減少黃瓜細菌性葉斑病病害，增加黃瓜產量具有一定的研究意義。