基質(zhì)膠對植入式葡萄糖傳感器外膜材料殼聚糖生物相容性的影響

沈 浩 劉 俊 敬微微 索永寬 常世杰 沙憲政#*

1(中國醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室，沈陽 110122)2(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361000)3(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001)

引言

由于異物反應(yīng)(如早期的急慢性炎癥反應(yīng)、纖維化的產(chǎn)生和血管的退化以及鈣化組織的形成等)的存在，造成植入式葡萄糖傳感器電極附近氧的供應(yīng)和葡萄糖傳質(zhì)的降低，使得傳感器于植入短期后在功能上產(chǎn)生明顯的下降，如靈敏度的降低、響應(yīng)時間的延長、輸出的不穩(wěn)定性等，無法達到長期、實時、準確、連續(xù)地檢測血糖的目的，最終設(shè)備失去應(yīng)用價值[1-2]。這就需要利用外膜材料對傳感器進行保護，以提高其在體內(nèi)的性能，延長使用壽命。天然高分子和合成高分子材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳感器外膜(如殼聚糖，聚氨酯等)，是傳感器制作封裝不可缺少的材料。可降解材料殼聚糖是一種應(yīng)用較為廣泛的天然高分子材料，是甲殼質(zhì)的脫乙酰衍生物，無毒，具有良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如緩釋材料、手術(shù)縫線等[3-5]。殼聚糖生物相容性較好[6]，而且殼聚糖可以制備成多孔的形式，有利于葡萄糖和氧氣等分子到設(shè)備的傳遞，但其仍會產(chǎn)生較強的炎癥反應(yīng)、纖維化，需要進一步改善。通常人們會探索新的材料，或者在良好材料的基礎(chǔ)上進行修飾，通過制備復(fù)合材料、增加緩釋系統(tǒng)等來達到提高生物相容性的目的[7-11]，但這些方法在材料的制備方面具有成本高、耗時長、工藝復(fù)雜等缺點，在應(yīng)用的過程中難以得到廣泛推廣。

基底膜是細胞外基質(zhì)的特化結(jié)構(gòu)形式，存在于多種組織之中。在室溫條件下，基底膜基質(zhì)能夠形成具有生物學(xué)活性的細胞外基質(zhì)，在一定程度上模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，有利于細胞的凝集、黏附、鋪展和遷移，并能促進干細胞分化，在組織工程修復(fù)研究中具有巨大潛力[12-14]。戴云等在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，基底膜基質(zhì)能夠定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨方向分化[15]。Ulrike Klueh等在葡萄糖傳感器涂上一層基于基底膜基質(zhì)的生物水凝膠，形成了具有良好生物相容性的外膜[16]。但是，目前很少有將基質(zhì)膠與天然材料結(jié)合共同應(yīng)用于傳感器等設(shè)備外膜的研究。

本研究選取基質(zhì)膠Matrigel作為研究對象，在殼聚糖良好的生物相容性基礎(chǔ)上，通過大鼠模型探討了基質(zhì)膠對膜材料生物相容性的影響。Matrigel是由BD公司從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出基底膜基質(zhì)膠，其主要成分有Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、硫酸肝素糖蛋白、巢蛋白，還包含生長因子(TGF-beta、EGF、IGF、FGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶等。在體內(nèi)，這些細胞外基質(zhì)成分形成特殊的三維結(jié)構(gòu)。除了支持細胞外，還能在細胞層和它們毗鄰的基質(zhì)層間形成一個界面，在傷口愈合以及組織重生領(lǐng)域起到重要的作用。在體外，Matrigel在25℃下能夠形成一種特殊的凝膠，還具有生物學(xué)活性。模擬體內(nèi)細胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成物理特性和功能，可用于形態(tài)、生物功能遷移侵襲和基因表達等的研究。利用基質(zhì)膠Matrigel的上述特性，結(jié)合殼聚糖的無毒可降解、生物相容性良好等特性，為進一步探究植入式傳感器設(shè)備外膜保護材料奠定了一定的基礎(chǔ)，使其能更好地應(yīng)用于體內(nèi)。

1 方法

隨機區(qū)組設(shè)計，自身對照動物實驗，于2015年12月-2016年12月在中國醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程實驗室、組織胚胎學(xué)實驗室完成。

1.1 實驗材料

1)主要試劑：殼聚糖粉末(CS，脫乙酰度為92.5%，浙江金殼生物化學(xué)有限公司)，Matrigel(20 mg/mL，BD公司)，硅膠顆粒(200-300目，國藥化學(xué)試劑有限公司)，NaOH粉末(北京化工廠，分析純)。

2)主要儀器：電子天平(METTLER TOLEDO EL104)，數(shù)字恒溫磁力攪拌器(85-2型，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)，LEICA圖像采集系統(tǒng)(德國徠卡公司)，PH計(METTLER TOLEDO DELTA 320)。

3)實驗動物：SD大鼠24只(雄性，體重200～300 g，鼠齡8周，中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)-2013-0001；使用許可證號：SYXK(遼)2013-0007)。

1.2 實驗過程

1)植入膜材料的制備：模板浸取法，硅膠作為致孔劑制備多孔殼聚糖膜，打孔器制成直徑約5 mm圓形膜片，置于75%酒精中，冰箱內(nèi)4℃保存；購買的Matrigel基質(zhì)膠(蛋白質(zhì)濃度為20 mg/mL)，分裝后通過低糖培養(yǎng)液稀釋為10和15 mg/mL兩種濃度，利用移液槍使用不同的槍頭取3種濃度的基質(zhì)膠各100 μL，分別滴涂到制備好的3個多孔殼聚糖的一側(cè)表面上，干燥后取3種濃度的基質(zhì)膠另100 μL，分別滴涂到3個多孔殼聚糖的另一側(cè)表面干燥后準備植入。全程使用無菌技術(shù)。

2)膜材料的皮下植入實驗：SD大鼠24只，隨機分6組，每組4只。將制備好的PCSM、滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM(直徑約為5 mm)，以脊柱為對稱軸，沿兩側(cè)各植入兩個圓形膜。

3)膜材料植入后的組織形態(tài)學(xué)觀察：在膜材料植入鼠皮下組織的第7、14、28、42、56和70 d時，用過量戊巴比妥鈉注射液腹腔注射，將每組的4只SD大鼠安樂死，植入的膜材料與周圍組織一同取出，修成大概0.5 cm3的小塊，用甲醛固定24～36 h，標準的程序制作常規(guī)石蠟切片，切片厚度5 μm，HE(蘇木精-伊紅)染色。

1.3 觀察指標

1)膜外炎性細胞面積比：利用IPP 6.0(Image-Pro Plus 6.0)軟件中的顏色分割和面積統(tǒng)計功能，觀察切片的蘇木精-伊紅染色在40倍鏡下的圖像照片，針對膜材料與皮膚和肌肉組織間藍染的細胞核進行面積統(tǒng)計，計算統(tǒng)計的藍染細胞核面積占中間區(qū)域總面積的百分比，每張切片選取5個視野(能夠基本覆蓋整個切片圖像)，先將5個數(shù)值做平均，再將每個周組的4只大鼠的數(shù)據(jù)匯總后取平均值。

2)膜外纖維包膜厚度：應(yīng)用IPP軟件中的距離測定功能，對蘇木精-伊紅染色10倍鏡下圖像照片中膜材料到皮膚和肌肉組織間的纖維厚度進行測定，在每張圖像照片近皮膚端和近肌肉端各隨機選取5個部位進行距離測量并記錄(此處認為5個大概覆蓋到膜長)，計算這5個值的平均值，待每個周組的4只大鼠的數(shù)據(jù)匯總后再取平均值。

3)膜外血管密度：通過IPP軟件統(tǒng)計膜材料周圍的微細血管的總面積，并計算其占膜材料到皮膚和肌肉組織間面積的百分比；通過目前國內(nèi)外判斷微血管的標準來確定膜材料周圍血管的位置，具有管腔、出現(xiàn)一個以上血管內(nèi)皮細胞、內(nèi)部含有1個以上紅細胞的區(qū)域。在蘇木精-伊紅染色圖像照片的40倍鏡下，隨機選取4～5個區(qū)域進行血管密度的測定，然后計算這些數(shù)據(jù)的平均值，每個周組的4只大鼠的數(shù)據(jù)匯總后再取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多孔殼聚糖膜周圍的組織形態(tài)學(xué)變化

初步觀察各實驗組與對照組的蘇木精-伊紅染色圖片(本研究主要觀察7、14 d急性炎癥反應(yīng)期，28 d后的慢性炎癥反應(yīng)在此不做描述)。可以看到，材料植入后第7 d時，膜材料周圍有一些藍色細胞核聚集，膜內(nèi)也有少量的藍染細胞核，此時幾乎沒有多少組織進入膜材料的空隙內(nèi)，圖1(a)所示為PCSM植入皮下組織7 d時的HE染色情況(100×)。圖1(b)為PCSM植入皮下組織14 d時的HE染色情況(100×)，膜外有大量的藍染細胞核聚集，膜內(nèi)也有一些的藍染細胞核，此時部分組織長入材料的空隙中。如圖1(c)、(d)所示，滴涂濃度為10和15 mg/mL時，基質(zhì)膠的PCSM植入皮下組織14 d時HE染色情況(100×)，膜外的藍核聚集較多，說明炎性細胞較多，核藍染顏色較深，反映炎性情況較強。第7和14 d時，其他組的形態(tài)學(xué)變化與以上描述相似。由于每個時間節(jié)點以及不同濃度下的圖片較多，不能全部列出，每個時間節(jié)點均隨機選取圖片進行描述(下同)。

第28 d時，膜材料周圍開始出現(xiàn)膠原纖維組織、一些炎性細胞堆積，形成了生物淤積，最終結(jié)果是產(chǎn)生了纖維包膜，此時，組織進一步長入到膜材料的空隙中，并且仍存在一定的炎癥反應(yīng)。圖2(a)為植入28 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為15 mg/mL的PCSM，膜周圍此時形成纖維包膜，并存在一定量的炎性反應(yīng)。圖2(b)為植入42 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL的PCSM，此時膜材料周圍纖維包膜相比28 d時變得致密一些，膜內(nèi)部的空隙中大部分區(qū)域被組織所填充，炎性細胞的數(shù)量也有所減少，此時慢性炎性反應(yīng)較28 d時減輕。圖2(c)為植入56 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為10 mg/mL的PCSM，纖維包膜進一步變得致密。圖2(d)為植入70 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為15 mg/mL的PCSM，此時膜材料周圍的纖維包膜厚度相比56 d時觀察變化不是十分明顯，開始趨向穩(wěn)定，藍染的核也較少，說明慢性炎癥正在減少。此時，組織幾乎填充了整個膜內(nèi)部的空隙。圖片均為HE染色，100×。

圖1 第7、14 d膜材料周圍組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，100×)。(a)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 7 d時；(b)未滴涂基質(zhì)膠的PCSM 14 d時；(c)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 14 d時；(d)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 14 d時Fig.1 Histomorphology changes of membrane materials at day 7 and day 14 (HE staining, 100×). (a) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 7; (b) PCSM without Matrigel at day 14; (c) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 14; (d) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 14

圖2 膜材料周圍纖維包膜情況(HE染色，100×;FC：纖維包膜)。(a)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 28 d時；(b)滴涂基質(zhì)膠濃度20 mg/mL的PCSM 42 d時；(c)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 56 d時；(d)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 70 d時Fig.2 Fibrous capsule situation around the membrane materials (HE staining, 100×; FC：fibrous capsule). (a) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 28; (b) PCSM with 20 mg/mL Matrigel at day 42; (c) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 56; (d) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 70

圖3(a)、(b)分別為第7、14 d時，滴涂濃度為10 mg/mL基質(zhì)膠的PCSM周圍血管的情況，此時膜材料周圍均生長出一些血管，并伴有一些炎性細胞，可以看出14 d時炎癥反應(yīng)較為強烈；圖3(c)為第28 d時，單獨植入PCSM周圍血管的情況；圖3(d)、(e)分別為第42、56 d時，滴涂濃度為15 mg/mL基質(zhì)膠的PCSM周圍血管的情況；圖3(f)為第70 d時，滴涂濃度為20 mg/mL基質(zhì)膠的PCSM周圍血管的情況。圖片均為HE染色(400×)，黑色箭頭所指為血管。

由圖3可以看出，無論是單獨植入PCSM還是植入滴涂基質(zhì)膠的PCSM周圍，均會有一些血管存在，因不同情況、不同時間、血管的多少有所不同，但從染色的圖像上無法判斷血管密度的大小，以及不同濃度基質(zhì)膠是否對PCSM周圍血管密度有影響，但通過這些血管便可計算膜外血管密度(即血管面積百分比)，以此來判定血管密度的大小。

圖3 各組膜材料周圍血管情況(HE染色，400×)。(a)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 7 d時；(b)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 14 d時；(c)未滴涂基質(zhì)膠的PCSM 28 d時；(d)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 42 d時；(e)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 56 d時；(f)滴涂基質(zhì)膠濃度20 mg/mL的PCSM 70 d時Fig.3 The situation of blood vessels around the membrane materials (HE staining,400×). (a) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 7; (b) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 14; (c) PCSM without Matrigel at day 28; (d) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 42. (e) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 56; (b) PCSM with 20 mg/mL Matrigel at day 70

2.2 膜材料周圍炎癥細胞比的統(tǒng)計分析

針對第7、14 d的情況，應(yīng)用IPP 6.0軟件，讀取蘇木精-伊紅染色切片的40倍鏡下照片統(tǒng)計膜外炎性細胞面積比，根據(jù)表1數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，如圖4所示。7 d時，各組膜材料周圍炎性細胞面積比大約在7%左右，而且相差不大；14 d時，各組這一數(shù)值均有所增加，達到9%左右。滴涂基質(zhì)膠后，膜外炎性細胞面積比要高于未滴涂時的情況，通過單因素方差分析，變化差異不具有顯著性(P<0.05)。整體上，14 d時的炎癥反應(yīng)要強于7 d時的炎癥反應(yīng)，不同基質(zhì)膠濃度組間差異不明顯。

表1 膜材料周圍炎性細胞面積比

2.3 膜外纖維包膜厚度的統(tǒng)計分析

應(yīng)用IPP軟件中的測距功能，測量28、42、56、70 d組植入皮下組織的膜材料周圍形成的纖維包膜厚度，統(tǒng)計取平均值，整理如表2、3所示。

通過對數(shù)據(jù)的直觀情況來看，纖維包膜厚度無論是近皮膚端還是近肌肉端均呈現(xiàn)降低的趨勢，纖維包膜變得致密并趨向于穩(wěn)定。對不同時間組纖維包膜厚度數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，如圖5所示，(a)～(d)分別為第28、42、56、70 d組膜材料周圍纖維包膜厚度柱形圖，厚度單位為μm。從柱形圖的變化趨勢可以看出，每個時間節(jié)點上，滴涂基質(zhì)膠組均降低了PCSM周圍的纖維包膜厚度，使其變得更加致密；但不同濃度基質(zhì)膠降低的幅度不同，其中20 mg/mL時降低的幅值最大，其效果最為顯著。從表2、3以及柱狀圖可以清晰地看到，近皮膚端數(shù)據(jù)與近肌肉端數(shù)據(jù)相近，滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍纖維包膜厚度均有所降低，不同濃度降低的幅度不同，基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL時較為明顯。利用單因素方差分析、結(jié)合Bonferroni法進行兩兩比較后，第42、56、70 d時，對照組與實驗組中滴涂基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL的多孔殼聚糖膜組差異具有顯著性意義，膜材料靠近皮膚端數(shù)據(jù)兩兩組比較的P值分別為0.01、0.035、0.024，靠近肌肉端數(shù)據(jù)P值分別為0.036、0.047、0.210，其他各組之間兩兩比較后的差異不顯著(P>0.05)，說明基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL時能有效降低膜材料周圍的纖維包膜厚度。從另一個角度分析，滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍纖維包膜厚度隨時間變化的曲線如圖6所示，其中(a)為近皮膚端數(shù)據(jù)，(b)為近肌肉端數(shù)據(jù)；不同濃度基質(zhì)膠隨時間均呈下降趨勢，15和20 mg/mL組下降較為明顯，尤其是20 mg/mL時。

圖4 7、14 d滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍炎性細胞面積比(橫軸C表示基質(zhì)膠濃度,C0、C10、C15、C20分別表示基質(zhì)膠濃度為0、10、15、20 mg/mL，縱軸A表示炎性細胞面積比)Fig.4 Inflammatory cell area ratio around PCSM coated with different concentrations Matrigel at day 7 and day 14(C0, C10, C15, and C20 represent the matrigel concentration on the PCSM, they are 0, 10, 15, 20 mg/mL, respectively)

表2 植入膜材料周圍纖維包膜厚度(近皮膚端)

表3 植入膜材料周圍纖維包膜厚度(近肌肉端)

圖5 膜材料周圍纖維包膜厚度柱狀圖。(a)28 d；(b)42d；(c)56 d；(d)70 dFig.5 Histogram of fibrous capsule thickness around the implanted membrane materials.(a)28 d；(b)42 d；(c)56 d；(d)70 d

2.4 膜外血管密度的統(tǒng)計分析

利用IPP 6.0軟件，對膜材料周圍血管密度進行統(tǒng)計分析，分別統(tǒng)計了4～5個視野下和8～10個視野下各周組膜外的血管密度，整理數(shù)據(jù)如表4所示。比較視野數(shù)量是否對膜外血管密度有影響，從數(shù)據(jù)觀察可知，兩種視野數(shù)下統(tǒng)計的膜外血管密度之間的差異不明顯。比較各時間點下滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍血管密度值可以看到，除了PCSM組在7、14 d 時血管增生較為明顯、數(shù)值較大，其他組血管密度大體上呈現(xiàn)隨時間增加而增大的趨勢，但血管密度相對較低，規(guī)律性不強。

圖6 滴涂不同濃度基質(zhì)膠的膜材料周圍纖維包膜厚度隨時間變化曲線(C0、C10、C15、C20代表滴涂到PCSM上的基質(zhì)膠濃度分別為0、10、15、20 mg/mL)。(a)近皮膚端；(b)近肌肉端Fig.6 Curve of the fibrous capsule thickness around the membrane coated with different concentrations of Matrigel (C0, C10, C15, and C20 represent the matrigel concentration on the PCSM, they are 0, 10, 15, 20 mg/mL, respectively) (a) Near the skin; (b) Near the muscle

3 討論

本研究在殼聚糖生物相容性良好的基礎(chǔ)上[17-18]，制備了多孔殼聚糖膜(PCSM)。在膜材料的表面滴涂基質(zhì)膠，旨在進一步提高PCSM的生物相容性，更好地作為傳感器外層保護膜，更好地保護設(shè)備。多孔材料能夠降低纖維包膜厚度，顯著地改善葡萄糖傳感器周圍的炎癥反應(yīng)、纖維包膜等情況[19-21]，但PCSM尚不能滿足實際需求。

在實驗中，通過動物模型探究了滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM的生物相容性。從形態(tài)學(xué)上觀察炎性反應(yīng)，雖然在第14 d時滴涂基質(zhì)膠的膜材料周圍的炎性反應(yīng)要強于未滴涂的情況，但從炎性細胞面積的百分比數(shù)據(jù)上觀察整體的差異性不明顯，方差分析結(jié)果表明差異不具有顯著性，說明基質(zhì)膠對炎性反應(yīng)的影響不是很大。纖維包膜厚度數(shù)據(jù)在相同的時間點，整體為滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍包膜厚度要低于單獨植入的PCSM包膜厚度，說明基質(zhì)膠能夠降低PCSM周圍形成纖維包膜的厚度，而且隨著時間推移，各組纖維包膜厚度降低的幅值是不相同的。基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL時，幅值降低的最大，說明基質(zhì)膠能有效地減少纖維包膜厚度，但此時并不代表基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL時就是最佳濃度，本研究只選取了3種濃度，分別為10、15和20 mg/mL，其中20 mg/mL為購買時的最大濃度。由于濃度的跨度相對較大，濃度范圍有限，并不能確定一個最佳濃度值，只能說基質(zhì)膠降低了膜材料周圍形成纖維包膜的厚度，且3種濃度中20 mg/mL最為有效，所以濃度的問題還需進一步探究。由膜材料周圍血管面積的百分比數(shù)據(jù)可知，血管生長情況各組間的變化規(guī)律不顯著，第7 d單獨植入PCSM周圍的血管密度要大一些，而滴涂基質(zhì)膠組數(shù)據(jù)要小一些，第14、42、56、70 d數(shù)據(jù)大體呈現(xiàn)增長的趨勢，也存在個別數(shù)據(jù)差別較大。在血管新生的調(diào)控機制上，近年來提出了血管新生因子平衡學(xué)說，正常情況下血管新生的誘導(dǎo)因子與抑制因子處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡被打破就會激活血管系統(tǒng)發(fā)芽長出新生血管。血管新生誘導(dǎo)因子有多肽類(如VEGF、bFGF、TGF-β等)[22-24]、未定性因子(如肝素)等，基質(zhì)膠中含有一些多肽類物質(zhì)(如TGF-β)，但卻沒有明顯促進血管增長，分析的原因主要有兩點：一是Matrigel基質(zhì)膠中這些血管新生誘導(dǎo)因子的含量具有不確定性；二是也可能由于基質(zhì)膠植入后一段時間的降解，一些活性物質(zhì)失活而失去了其作用。另外，研究中沒有分析植入位置對實驗組和對照組數(shù)據(jù)結(jié)果的影響，希望今后能加以補充。

此外，對指標的評價也可能受到實驗條件的限制。本實驗主要是利用組織形態(tài)學(xué)方法，結(jié)合IPP圖像分析軟件對指標進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SPSS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，相對來說是從宏觀的角度進行了分析，統(tǒng)計的實驗組和對照組數(shù)據(jù)需要進一步完善和改進。Arturo J Vegas[25]等在較新的一項研究中，利用合成的復(fù)合物TMTD(triazole-thiomorpholine dioxide)修飾的藻酸鹽微球體作為外膜保護材料，保護能產(chǎn)生胰島素的SC-β細胞，產(chǎn)生胰島素降低血糖，并且探討了TMTD修飾的藻酸鹽微球體的生物相容性，從微觀的細胞學(xué)角度進行了分析，在植入部位的組織及材料處提取細胞，用流式細胞儀分離出巨噬細胞和中性粒細胞等；通過免疫熒光染色技術(shù)，對細胞沉積(DAPI染細胞核和纖維蛋白)和肌成纖維細胞(染α-平滑肌蛋白)進行了染色處理，結(jié)果表明在材料上有較低的細胞沉積水平，而在蛋白提取物的蛋白質(zhì)組分析中也進一步表明，材料能夠減少纖維化反應(yīng)。因此，探究新的材料或者新的復(fù)合方法時，需評價其生物相容性，為了使評價結(jié)果更加準確，應(yīng)結(jié)合組織形態(tài)學(xué)方法、統(tǒng)計學(xué)法以及微觀細胞學(xué)等方法，從多方面、多角度進行評價。

4 結(jié)論

通過大鼠模型、結(jié)合形態(tài)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法，探究了基質(zhì)膠與多孔殼聚糖膜相結(jié)合后的生物相容性。對多孔殼聚糖膜滴涂不同濃度的基質(zhì)膠，將其植入動物皮下組織后，在炎性反應(yīng)、形成纖維包膜厚度以及血管密度等方面進行了分析，表明基質(zhì)膠能有效地降低形成的纖維包膜厚度，在一定程度上提高血管密度，促進血管的生成。整體來看，基質(zhì)膠可在一定程度上提高PCSM的生物相容性，進一步提高膜材料的性能。未來應(yīng)對基質(zhì)膠結(jié)合多孔殼聚糖膜的生物相容性，在基質(zhì)膠濃度和膜材料植入部位進行探究，探索是否存在一個最佳濃度以及植入部位對其相容性的影響，并結(jié)合一些蛋白質(zhì)(如纖維蛋白)含量的測定，從而更好地對材料進行評價，為更好地應(yīng)用到體內(nèi)奠定基礎(chǔ)。

(致謝：感謝中國醫(yī)科大學(xué)組胚教研室翟效月老師在組織切片過程中提供的幫助)