腸道真菌菌群失調對小鼠角膜創傷修復的影響

賈路路，路頂立，劉素素，陳雨晴，李志杰,2，王麗婭

0引言

角膜創傷是眼科常見的急癥，角膜創傷的愈合是一個重要的臨床問題，快速良好的角膜創傷修復對于恢復角膜完整性和視力至關重要。角膜的創傷修復是一個動態、有序的過程，涉及到復雜的細胞和分子機制。這一過程中生長因子和細胞因子是重要的調節因子，可刺激參與傷口愈合的細胞生長、增殖、遷移、分化、黏附，以及細胞外基質沉積和蛋白酶調節等[1-2]。動物實驗研究顯示，在角膜創傷修復的初期，角膜上的免疫細胞通過角膜緣血管網向創傷區域遷移，通過釋放大量的生長因子、細胞因子和各種酶類等物質促進創傷的愈合。其中中性粒細胞和γδT細胞發揮著重要的作用[3-5]。因此，任何破壞或者干擾炎癥細胞功能和免疫反應過程的因素都會造成角膜創傷修復的延遲。

哺乳動物腸道存在著多樣復雜的共生微生物，其中包括細菌、古生菌、真菌、病毒等。人體腸道中約定植1012～1014個微生物，基因總量是人基因的150倍，被稱為人類的第二套基因組[6]。大量研究表明，腸道微生物參與人體的營養代謝、腸道功能、免疫調節等生理過程，腸道微生態的失調常伴隨多系統疾病的發生，如心腦血管疾病、肥胖、糖尿病，甚至神經組織的修復再生等[7-10]。這些研究主要闡明腸道細菌與疾病發生和發展的關系，但在腸道真菌方面研究甚少。腸道真菌作為腸道微生態的重要一員，亦有著不可忽視的作用。長期口服抗真菌藥物兩性霉素B可造成腸道真菌菌群失調，增加炎癥性腸道疾病和過敏性呼吸道疾病的嚴重程度。并且兩性霉素B在腸道幾乎不可吸收，因此可以排除腸道外非特異效應的作用[11-12]。本研究通過兩性霉素B誘導腸道真菌菌群失調，從而探索腸道真菌菌群失調對角膜創傷修復的影響，試圖從腸道真菌菌群方面為角膜創傷的治療提供思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級C57BL/6J雄性小鼠60只，8～12周齡，體質量23～25g，均購自南京大學-南京生物醫藥研究院，裂隙燈下檢查雙眼角膜均無病變。小鼠的飼養與使用均遵照視覺與眼科研究協會制定的科研動物使用規范，經河南省眼科學與視覺科學重點實驗室管理與倫理審查委員會批準。動物飼養環境為12h光照/12h黑暗(上午6∶00開燈，下午6∶00關燈)的循環周期。

1.1.2主要實驗試劑免疫熒光試劑FITC/Gr-1(553127，BD Bioscience)；PE/GL3(553178，BD Bioscience)；4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(944021，美國Invitrogen公司)；Bovine Serum Albumin(9048-46-8，BIOSHARP)；Triton X-100(T8200，北京索萊寶科技有限公司)；封片膠(F4680-25ML，美國Sigma公司)；多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；熒光素鈉(H11619-1009，美國Alcon公司)；兩性霉素B(大連美侖生物技術有限公司)；糞便樣本DNA提取試劑盒(Omega)。

1.1.3主要儀器設備手術顯微鏡(YZ20T4，蘇州六六視覺科技股份有限公司)；超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術公司)；裂隙燈(SL.8Z，日本Topcon)；解剖顯微鏡(Discovery V20，德國Zeiss)；熒光顯微鏡(Eclipse 80i，日本Nikon)；單光子共聚焦熒光顯微鏡(NikonC1Si，日本)；移液器(法國Gilson)；角膜剪和顯微無齒鑷(蘇州明仁醫療器械廠)；環鉆(2mm，美國)；高爾夫刀(Accutome，美國)；分析天平(PL402-L，瑞士)。

1.2方法

1.2.1誘導小鼠腸道真菌菌群失調利用抗真菌藥物兩性霉素B誘導小鼠腸道真菌菌群失調，選取體質量均一(23±2g)、角膜無病變小鼠60只，隨機分為兩組：兩性霉素B組(Amph)與對照組(Ctrl)。兩性霉素B組按60mg/(kg·d)的劑量將兩性霉素B加入小鼠飲食中喂養4wk[13]，對照組正常飲食喂養4wk。

圖1 角膜分區模式示意圖(1區為角膜緣區，5區為角膜中央區)。

1.2.2小鼠糞便樣本收集和DNA提取飼養4wk后將待取樣小鼠放入鋪有滅菌濾紙的籠子內，每籠1只小鼠，排便后立即用無菌棉簽收集小鼠糞便，不同的小鼠取樣要更換新的濾紙。采集的小鼠糞便參照糞便樣本DNA提取試劑盒使用方法(E.Z.N.A.TMStool DNA Kit)提取樣本DNA。采用包含“GTGAATCATCGARTC”序列的上游引物和包含“TCCTCCGCTTATTGAT”序列的下游引物擴增真菌ITS rDNA上的ITS2高變區，構建高通量測序文庫并檢測，然后利用Illumina MiSeq PE250平臺進行測序。測序結果經過分析，得到樣本物種信息。

1.2.3小鼠角膜上皮創傷兩性霉素B誘導腸道真菌菌群失調后，于中午12∶00制作小鼠角膜上皮創傷模型。10g/L戊巴比妥鈉按80mg/kg劑量腹腔注射麻醉小鼠。解剖顯微鏡下使用環鉆在小鼠角膜中央標記直徑為2mm圓形區域，采用高爾夫刀機械性刮除標記圓形區域的角膜上皮細胞層[5]。以上過程均在超凈工作臺中進行。

1.2.4角膜上皮創傷修復觀察創傷后0、6、12、18、24、30h采用20g/L熒光素鈉溶液染色兩組小鼠角膜，在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜創傷修復情況并拍照，通過圖像處理軟件Photoshop CS6(13.0.1)計算創傷區域面積。

1.2.5角膜免疫熒光標記兩組小鼠分別于創傷后0、6、12、18、24、30、36h各時間點分別處死3只小鼠，取角膜組織，修剪角膜去除虹膜、晶狀體等組織，于2%多聚甲醛中固定40min，固定后1×PBS沖洗角膜，添加0.2%Triton-BSA溶液中室溫破膜、封閉30min，然后分別加入FITC/Gr-1、PE/GL3，4℃避光孵育過夜，次日加入1μg/mL DAPI染液，避光室溫染色。染色后取出角膜組織，1×PBS沖洗。將角膜上皮層朝上使用手術刀片將角膜均勻切割成4瓣平鋪于載玻片上，使用封片膠封片。

1.2.6分裂細胞、中性粒細胞和γδT細胞定量分析小鼠角膜進行免疫熒光染色后，對角膜中分裂細胞、中性粒細胞和γδT細胞進行定量分析。將角膜從角膜緣到角膜中央依次分為1～5區(圖1)。在單光子共聚焦顯微鏡40倍油鏡下分別計數角膜兩條直徑上從一側角膜緣到另一側角膜緣9個視野DAPI標記的分裂細胞、PE/GL3標記的γδT細胞。單光子共聚焦顯微鏡斷層掃描角膜兩條直徑上第4區FITC/Gr-1標記的嗜中性粒細胞，然后使用Imaris7.2.1軟件進行定量統計。

圖2 兩組小鼠腸道真菌菌群在門、綱水平上的構成 A：門水平；B：綱水平(不同顏色表示不同菌群)。

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

表2 兩組小鼠創傷后不同時間點分裂細胞計數

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

1.2.7角膜上皮厚度測量兩組分別于創傷后24、48、96h各處死3只小鼠，取下完整小鼠眼球，經固定、脫水浸蠟、包埋、切片、脫蠟等過程，制作石蠟切片并進行HE染色，在顯微鏡10倍物鏡下拍攝圖像并使用Image J軟件進行角膜厚度定量計算。

2結果

2.1兩性霉素B誘導后小鼠腸道真菌菌群發生改變小鼠糞便樣本ITS rDNA測序結果顯示：兩性霉素B處理4wk后，小鼠腸道真菌菌群多樣性和結構發生改變，其中Alpha多樣性分析顯示兩組Shannon指數差異有統計學意義(P=0.02)，其余各項指標差異無統計學意義(表1)。說明抗真菌藥物處理后腸道真菌菌群的多樣性存在一定程度的差異。腸道真菌菌群結構分析顯示，在門水平上，兩組間擔子菌門(basidiomycota)和接合菌門(zygomycota)差異有統計學意義(P=0.032、0.008，圖2A)；在綱水平上，兩組酵母菌綱(saccharomycetes)、黑粉菌綱(ustilaginomycetes)及微球黑粉菌綱(microbotryomycetes)差異有統計學意義(P=0.008、0.016、0.032，圖2B)。結果證明，兩性霉素B處理后造成小鼠腸道真菌菌群改變。

2.2腸道真菌菌群失調對小鼠角膜創傷再上皮化的影響角膜上皮創傷后，兩組小鼠角膜均逐漸進行修復，Ctrl組小鼠創傷后24h熒光素鈉染色角膜上皮無著染，而Amph組仍有部分著染，并且創傷后30h仍有著染(圖3A)。Amph組小鼠與Ctrl組小鼠相比，角膜創傷后再上皮化速度明顯延緩(圖3B)。創傷后，兩組分裂細胞數量持續增加，但Amph組上皮層分裂細胞總數顯著低于Ctrl組，各時間點比較差異均有統計學意義(表2)。實驗表明腸道真菌菌群失調導致小鼠角膜創傷后再上皮化時間延長，上皮層分裂細胞數量與Ctrl組相比顯著下降。

圖3 兩組小鼠角膜創傷修復的動態變化 A：創傷后不同時間點熒光素鈉染色顯示創傷面積；B：創傷后各時間點兩組的角膜創傷面積占創傷原始面積百分比(aP<0.05，bP<0.01 vs Ctrl組)。

圖4 兩組小鼠創傷后48h角膜HE染色和上皮層厚度定量 A：創傷后48h角膜上皮組織形態變化(×100)；B：創傷后48h角膜上皮厚度定量計算(bP<0.001 vs Ctrl組)。

表3 兩組小鼠創傷后不同時間點γδT細胞計數個/視野)

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

表4 兩組小鼠創傷后不同時間點中性粒細胞計數個/視野)

注：Ctrl組：對照組；Amph組：兩性霉素B組。

2.3腸道真菌菌群失調對小鼠角膜炎癥細胞的影響通過觀察創傷后炎癥細胞的數量變化，說明腸道真菌菌群失調對炎癥反應的影響。兩組γδT和中性粒細胞數量在創傷后均明顯增加，但是與Ctrl組相比，Amph組角膜兩條徑線上γδT細胞數量顯著下降(表3)，中性粒細胞數量也明顯降低(表4)。結果表明，腸道真菌菌群失調小鼠創傷后炎癥反應降低，炎癥細胞數量明顯減少。

2.4腸道真菌菌群失調對創傷修復后角膜厚度的影響Amph組小鼠角膜創傷后上皮厚度在創傷后24、48、96h均小于Ctrl組(t24h=2.60，P24h=0.014；t48h=7.58，P48h<0.01；t96h=2.85，P96h=0.007)，創傷后48h時Amph組角膜上皮厚度為10.02±1.62μm，Ctrl組小鼠角膜上皮厚度為14.58±1.97μm，差異有統計學意義(P<0.001，圖4)。表明腸道真菌菌群失調小鼠角膜創傷后再上皮化及復層化能力顯著降低，角膜上皮厚度下降。

3討論

創傷后炎癥反應是組織完成修復的一個必經過程[14]。組織創傷后通過一系列的微血管反應，大量的炎癥因子和其他因子等刺激微血管擴張、血管內皮細胞間隙增大、黏附分子表達增加，促使炎癥細胞向創傷區域遷移、浸潤[15]。角膜創傷后，γδT細胞在趨化因子CCL20的誘導下聚集在角膜上皮層，γδT細胞可以產生IL-17、IL-20和IL-22等炎癥因子，促使中性粒細胞向創傷區域的募集和上皮細胞的分裂，從而誘導炎癥反應和促進上皮修復，TCRδ-/-小鼠角膜創傷后表現出炎癥反應的降低、創傷愈合的延遲，在創傷后96h上皮細胞密度的降低，所以γδT細胞在角膜創傷后中性粒細胞在角膜緣血管中的定位和上皮細胞的有絲分裂至關重要[4-5,16]。創傷早期，白細胞的遷移可以促進再上皮化，研究表明通過抗體中和法去除中性粒細胞的小鼠角膜創傷愈合延遲，證明中性粒細胞參與創傷修復[17]。本研究中，角膜上皮創傷后，角膜緣γδT細胞和中性粒細胞均迅速增多，中性粒細胞在創傷后迅速向創傷區域遷移，但創傷后6、12h中性粒細胞在第4區計數差異無統計學意義，可能是炎癥反應初期中性粒細胞仍未大量遷移至創傷區域，但創傷后24h在角膜第4區浸潤量達高峰，之后又逐漸恢復正常。但腸道真菌菌群失調組γδT細胞在角膜緣聚集明顯減少，分裂細胞數量和中性粒細胞的浸潤減少，導致角膜創傷的愈合延遲，在創傷后24、48、96h角膜上皮厚度均較對照組明顯減少，這也驗證了上述研究的結果。所以正常的免疫反應在角膜創傷修復中占有重要地位。

正常的腸道菌群對免疫系統具有重要作用。過去的研究表明，腸道細菌對調節機體穩態和免疫反應至關重要；然而，近幾年來研究發現腸道真菌對這些過程也有很大的影響[18-19]。新的研究表明，真菌菌群的破壞可能會對宿主免疫系統產生有害影響[20-22]。在對慢性酒精性肝硬化、強直性脊柱炎等疾病的研究中，均發現腸道真菌菌群多樣性和結構上的改變，這些疾病的發生和腸道真菌菌群之間關系密切[13,23]。研究表明在宿主抗真菌的免疫反應中NF-κB信號通路發揮重要作用[24]，并且IL-22、IL-17參與腸道黏膜免疫反應，直接參與控制腸道真菌菌群，缺乏IL-22的小鼠胃腸道更易感染念珠菌[18,25]。而NF-κB信號通路被認為是與角膜創傷后炎癥反應關系最密切的調控分子，IL-17和IL-22在角膜創傷修復中也有重要的作用[26]。因此我們推測，腸道真菌失調可能通過多種機制影響局部和全身免疫狀態，其中包括調節細胞因子環境、激活不同細胞類型和釋放代謝物等[22]，從而影響了創傷修復中炎癥反應的信號傳導通路、炎癥細胞的遷移和募集、炎癥因子和其他調節因子的產生，進一步降低了炎癥反應并延緩修復過程。

本實驗采用屬于近交系的C57小鼠，因其具有基因純合度高、遺傳背景明確、動物模型重復性較好的優點，所以我們前期很多研究都建立在C57小鼠上，其它品系小鼠是否會有不同的研究發現，可以作為我們下一步新的研究方向。另外本研究發現抗真菌藥物處理后腸道真菌中一些菌群發生明顯變化，但在國內外文獻中未見對這些顯著差異菌屬的研究報道，因此其與機體免疫反應和腸道微生態的相關性不甚明確，對角膜創傷修復的影響更是知之甚少。并且腸道真菌和細菌之間有著密切的拮抗、互利、共生關系，可以通過物理接觸和分泌分子直接發生，或者通過改變宿主的免疫反應間接發生[22,27]。那么小鼠角膜創傷修復的延遲是由腸道真菌菌群失調直接導致還是間接的細菌改變所造成，仍需要后續大量的實驗來驗證。本研究雖然發現腸道真菌菌群的失調延緩了角膜創傷的修復，但是未能揭示腸道真菌菌群的具體作用機制以及與角膜創傷修復的相互關系，這將是我們下一步研究的方向和重點。