堿燒傷誘導兔部分性角膜緣干細胞失代償模型

高晴琴, 王 平, 王 娟, 孫 明, 徐玲娟, 王 瑋, 朱 暉, 江夢琳, 胡維琨, 李新宇, 李貴剛

0引言

角膜上皮位于正常角膜的最表層，是保護角膜免受病原體侵害的重要屏障，對保持角膜的完整和透明性至關重要。角膜上皮由復層鱗狀上皮細胞組成，一生都處于不斷地更新保持動態平衡狀態[1]。正常角膜緣干細胞(limbal stem cells，LSC)是維持角膜上皮更新的必備條件。LSC可以分裂為兩種細胞，一種是新一代的LSC細胞，維持恒定的干細胞群，這個過程被稱為自我更新(self-renew)；另一種是瞬時擴增細胞(transit amplifying cells，TAC)，這一過程被稱為分化(differentiation)，TAC細胞具有旺盛的分裂增殖能力，向角膜中央不斷移行，以填充角膜上皮的基底層，這些基底細胞可以持續分裂或進入細胞周期，形成角膜基底層上皮細胞和成熟的表層上皮細胞[2-3]。各種原因都會造成LSC的損傷，從而導致角膜緣干細胞失代償(limbal stem cell deficiency，LSCD)，如化學或熱燒傷，Stevens Johnson綜合征、Sj?gren綜合征及其他眼表慢性炎癥。LSCD可以導致角膜上皮遷延不愈、角膜上皮結膜化、角膜新生血管、角膜混濁等病理改變，從而嚴重影響患者視力乃至致盲，并且成為同種異體角膜移植失敗的重要原因。

近年來，許多研究小組運用各種動物、不同方法制作LSCD模型，用以研究LSCD發生機制，并期望尋找治療這一疾病的最佳方法，LSCD模型的制作是這類相關研究的基礎。本研究采用去除兔第三眼瞼的方法，有效利用了顳上方角膜結膜容易暴露觀察的特點，記錄了一組采用堿燒傷誘導兔部分性LSCD的動物模型制作新方法，現報告如下。

1材料和方法

1.1材料選取30只眼部健康的C57小鼠、19只眼部健康新西蘭白兔、1mol/L KOH溶液(0.56g KOH溶于10mL去離子水中配制而成)、濾紙、氯胺酮、0.25%鹽酸奧布卡因滴眼液、生理鹽水、0.5%鹽酸左氧氟沙星滴眼液、醋酸纖維素微孔濾膜、4%多聚甲醛、Schiff氏溶液、蘇木素染液、亞硫酸鈉溶液、PBS液、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、蒸餾水、1%鹽酸酒精、二甲苯、伊紅染液。

1.2方法本研究由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院倫理委員會審核通過,并遵守實驗動物操作倫理學規定。

1.2.1小鼠完全性LSCD模型制作方法根據文獻報道的方法[4]，小鼠中央角膜堿燒傷誘導LSCD。C57小鼠腹腔內注射氯胺酮(100mg/kg)全身麻醉，左眼滴0.25%鹽酸奧布卡因滴眼液，每分鐘1次合計3次表面麻醉。取直徑3mm圓形濾紙片置于1mol/L氫氧化鉀溶液中浸潤，用鑷子夾取濾紙片，在一張新的濾紙上吸掉多余的液體，置于左眼中央角膜表面與角膜緊密貼敷，燒灼30s，用20mL生理鹽水充分沖洗(圖1A)。右眼不做燒灼，作為正常對照。

1.2.2兔部分性LSCD模型制作方法新西蘭白兔肌肉注射氯胺酮(35mg/kg)全身麻醉，左眼滴0.25%鹽酸奧布卡因滴眼液，每分鐘1次合計3次表面麻醉，剪刀去除兔眼瞬膜(第三眼瞼)，取直徑5mm圓形濾紙片置于1mol/L氫氧化鉀溶液中浸潤，將浸濕的濾紙片置于顳上方角膜表面，30s后立即用生理鹽水沖洗(圖1B)，右眼作為正常對照。

1.2.3角膜印跡細胞學檢查方法兔結膜囊內滴0.25%鹽酸奧布卡因1滴，等待2min后用濾紙吸去多余淚液,顯微無齒鑷夾取己消毒的醋酸纖維素薄膜濾紙(預先裁剪為高約4mm的三角形)，將三角尖對角膜，底邊對結膜，粗糙面貼于球結膜、病變角膜及透明角膜處，稍加壓10s，印取表層上皮細胞，將濾紙片置于4%多聚甲醛溶液中固定，固定好的樣品采用PAS染色(periodic acid-schiff stain)之后放置于顯微鏡下觀察。

圖1 角膜堿燒傷法誘導LSCD示意圖 白色區域為角膜表面濾紙片燒灼部位，采用1mol/L氫氧化鉀溶液浸泡濾紙片燒灼30s，再用生理鹽水沖洗干凈 A：C57小鼠，濾紙片直徑3mm；B：新西蘭白兔，濾紙片直徑5mm。T：顳側N：鼻側。

圖2 鼠完全性LSCD模型不同階段前段照相及2mo病理切片 A：正常小鼠角膜；B：小鼠角膜堿燒傷后2wk；C：小鼠角膜堿燒傷后2wk，角膜混濁，新生血管長入；D：小鼠角膜堿燒傷后1wk，角膜穿孔；E：堿燒傷2mo鼠完全性LSCD模型角膜切片HE染色，上皮層可見大量杯狀細胞(×400)；F：堿燒傷2mo鼠完全性LSCD模型角膜切片HE染色，基質層可見大量新生血管(×400)。

1.2.4 HE染色方法對取得的角膜組織進行石蠟包埋、切片后用二甲苯進行脫蠟，隨后分別用無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇以及蒸餾水進行復水，用蘇木素染液進行細胞核染色之后再用伊紅染液進行細胞質染色，隨后分別用70%的乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇進行脫水，將脫水后的切片放入二甲苯中浸泡使切片透明，最后用快干膠將切片封固，置于顯微鏡下觀察。

1.2.5觀察指標小鼠及白兔角膜堿燒傷后雙眼滴用0.5%鹽酸左氧氟沙星滴眼液，4次/d。術前、術后1、2、4wk,2mo采用裂隙燈顯微鏡觀察、攝像，觀察角膜上皮愈合時間，記錄角膜潰瘍、穿孔等并發癥。術后2mo處死小鼠，角結膜切片檢測角膜新生血管分布情況。計算堿燒傷誘導鼠完全性LSCD模型成功率。術后2mo采用印跡細胞學檢測兔眼表杯狀細胞分布(正常角膜區域、LSCD角膜區域、結膜)。處死動物，角結膜切片觀察角膜新生血管、杯狀細胞密度。計算利用堿燒傷誘導兔部分性LSCD模型成功率。

LSCD的診斷標準: (1)裂隙燈檢查見全部或部分角膜緣正常結構喪失、角膜新生血管。(2)角膜印跡細胞學檢查可見杯狀細胞[5-7]。

2結果

角膜堿燒傷后觀察2mo，30只小鼠中，6只因麻醉意外死亡，2只分別在第7d和第14d出現了角膜穿孔，其余 22只小鼠發生不同程度完全性LSCD，誘導成功率92%，表現為角膜新生血管、角膜混濁。19只白兔，其中7只因麻醉意外死亡，12只白兔造模成功,誘導成功率100%，在觀察過程中，未出現角膜穿孔的情況。兩種方法造模成功率比較差異無統計學意義(P=0.543)。

正常小鼠結膜無充血，角膜透明，角膜緣血管網清晰可見，通過透明的角膜，可以清晰顯示虹膜紋理、瞳孔大小、晶狀體透明(圖2A)。角膜中央堿燒傷后2wk，部分小鼠LSCD程度適中，表現為無明顯充血，中等程度角膜新生血管，纖維血管膜長入角膜，中央角膜混濁，無法透過角膜看清虹膜及瞳孔情況，這是比較理想的LSCD模型(圖2B)。角膜中央堿燒傷后2wk，部分小鼠LSCD程度嚴重，表現為睫狀充血+++，大量角膜新生血管，中央角膜潰瘍，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況，這種LSCD很難治愈，不是理想的LSCD模型(圖2C)。角膜中央堿燒傷后1wk，部分小鼠角膜潰瘍穿孔，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況，這種被判定為LSCD模型制作失敗，無法用于進一步的LSCD治療模型(圖2D)。堿燒傷后2mo，小鼠角膜病理切片HE染色可見角膜上皮杯狀細胞長入(圖2E)，基質有大量新生血管(圖2F)。

圖3 兔部分性LSCD模型不同階段前段照相和印記細胞學PAS染色及病理切片 A、E：堿燒傷后1wk；B、F：堿燒傷后2wk；C、G：堿燒傷后1mo；D、H：堿燒傷后2mo；I：堿燒傷后2mo兔部分性LSCD模型正常角膜部分印跡細胞學PAS染色陰性(×400)；J：堿燒傷后2mo病變角膜印跡細胞學PAS染色顯示大量杯狀細胞(×400)；K：堿燒傷后2mo角膜切片HE染色，上皮層可見大量杯狀細胞(×200)；L：堿燒傷后2mo角膜切片HE染色，基質層可見大量新生血管(×200)。

兔角膜堿燒傷后1wk，表現為輕度角膜新生血管，尚未見纖維血管膜長入角膜，角膜燒傷局部混濁明顯，無法透過角膜看清虹膜及瞳孔情況，其他部位可透過角膜看清虹膜及瞳孔紋理(圖3A)，燒傷局部角膜上皮熒光素鈉染色陽性(圖3E)。兔角膜堿燒傷后2wk，LSCD程度適中，表現為中等程度角膜新生血管，纖維血管膜長入角膜，燒傷局部角膜混濁明顯，其他部位角膜輕度混濁，可隱約窺見虹膜及瞳孔紋理(圖3B)，角膜熒光素鈉染色見局部角膜上皮缺損范圍增大(圖3F)。角膜堿燒傷后1mo，表現為角膜大量新生血管，角膜混濁加重，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況(圖3C)，角膜熒光素鈉染色可見大片上皮缺損(圖3G)。角膜堿燒傷后2mo，結膜無充血，角膜上皮愈合，新生血管減少，角膜混濁，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況(圖3D)，角膜熒光素鈉染色陰性(圖3H)。透明角膜部位印跡細胞學PAS染色未見杯狀細胞(圖3I)，混濁角膜部位可見大量杯狀細胞(圖3J)。角膜病理切片HE染色可見角膜上皮杯狀細胞長入(圖3K)，基質新生血管主要位于淺層(圖3L)。堿燒傷后2mo，2只白兔角膜新生血管累及2個象限，其余10只白兔均僅累及1個象限，平均累及1.17±0.39個象限。在高倍鏡(HP,×400)下對12只兔部分性LSCD模型的角膜杯狀細胞計數，平均角膜杯狀細胞數為58.60±12.58個細胞/HP。

3討論

3.1模型動物選擇兔還是小鼠用于制作LSCD模型的動物大多選用兔[8-27]和小鼠[4-5,28-29]，兔眼大小更接近人眼，與小鼠相比角膜面積更大，因此有利于模型成功和手術操作。且兔子性情溫順，極少傷人，在制作LSCD模型時更易操作、更易觀察，拍攝照片時也更加清晰。Ti等[11]在完全性LSCD兔模型上觀察到鼻側的新生血管多于其他方向，認為兔眨眼速度慢，且存在瞬膜，會對眼表施加額外的摩擦力，尤其是鼻側。瞬膜的存在可能會影響堿燒傷的操作和日常的角膜病變觀察記錄。因此我們選擇去除兔眼的瞬膜，這樣在觀察和拍照的時候就可以不受此影響。小鼠的眼球較小，進行操作、測量新生血管面積及照相的難度都較兔子大，但小鼠可供選擇的抗體較兔子齊全，有利于在同類研究中的比較。因此兩種動物模型各有優缺點。

3.2完全性LSCD模型還是部分性LSCD模型就近幾年的研究來看，制作完全性LSCD模型[5,8,11-15,18,20-25,28-29]的研究遠遠多于部分性[9-10,16-17,19]。但是這種研究模型在檢驗治療方法的有效性的時候有一定局限性，因為合并嚴重的角膜病變，無論是研究組還是陽性對照的治療方法都不容易獲得治愈效果，或者治療效果不顯著，這樣就難以做出治療方法的優劣性判斷。角膜化學傷誘導LSCD，目前報道的均為完全性LSCD，往往合并嚴重的角膜混濁、深層新生血管等病變。由于中央角膜堿燒傷損傷范圍大，容易發生角膜潰瘍不愈合、角膜穿孔而導致造模失敗。Ma等[4]在研究骨髓間充質干細胞重建鼠化學燒傷眼表時發現，80只鼠在化學燒傷1wk后有29只(36%)因出現了嚴重的前房積血、前房積膿、角膜穿孔而退出研究。郭濱等[27]運用不同堿燒傷方法制作兔完全性LSCD模型時A組兔眼由于NaOH在角膜緣停留時間過長，6只眼全部出現角膜穿孔、眼球萎縮而造模失?。籅、C組造模成功但B組因為在結膜囊滴入NaOH而導致瞼球粘連。瞼球粘連并非是LSCD的必要體征，且不利于后期進行LSCD治療方法的相關研究。相反，如果LSCD動物模型的損傷比較局限于表層組織，那么治療方法容易取得眼表健康改善、視覺改善等陽性指標，并與對照組形成比較明顯的對比，從而發現有用的治療方法，并且客觀定量評價治療效果。

此外，由于動物角膜暴露困難，完全性LSCD模型不便于觀察和照相，以及印跡細胞學檢查等操作。而部分性LSCD模型更便于觀察，前段照相時兔配合情況好，燒傷操作時更易精確控制部位和時間，成功率高。在研究LSCD微環境重建，比如角膜緣微環境細胞(limbal niche cells，LNC)的移植時，就更適合采用仍存有部分自體角膜緣干細胞的部分性LSCD模型。

盡管堿燒傷誘導兔部分性LSCD模型與堿燒傷誘導鼠完全性LSCD模型的成功率差異無統計學意義，但前者在2mo的時候已經進入無充血、角膜上皮結膜化的炎癥穩定階段，而這是接下來用于檢驗LSCD治療方法有效性的理想狀態。相對于以往報道的3mo制作時間，這種動物模型具有縮短實驗周期，提高研究效率的優點。

3.3使用機械手法還是堿燒傷制作的LSCD動物模型的方法主要有2種，一種是機械損傷角膜緣[8-11,14-15,17,19-22,25-26,29]；另一種是化學燒傷，多采用堿，如NaOH[4-5,12-13,20-21,23-24,27]、KOH[16]等，少見的有硫芥子氣[18]。機械損傷角膜緣的優點是可控性較好，可以誘導不同程度的LSCD，包括完全性LSCD和部分性LSCD[30]，然而這種模型與臨床病例的吻合度較低，因為臨床上最常見的LSCD發病原因為各種化學或熱燒傷。2017年中山眼科中心的一項研究對堿燒傷和角膜緣機械切除聯合角膜上皮刮除這兩種方法制作的完全性兔LSCD模型進行了比較。該研究表明這兩種方法均可造模成功，堿燒傷組的角膜混濁、新生血管化較機械切除組嚴重，適合用于與新生血管相關的研究；角膜緣機械切除聯合上皮刮除對角膜基質的損傷較小，角膜基質的微環境保存良好，更適合于研究干細胞的分化、轉化、干細胞相互作用、微環境及干細胞替代療法[21]。機械手法對術者技巧要求較高，無疑增加了可重復性的難度。最重要的是，在臨床中導致LSCD的病因并非機械損傷，而是化學燒傷，特別是堿燒傷所導致。所以，采用堿燒傷的方法制作LSCD模型更貼合臨床患者的實際情況。

綜上所述，目前關于制作LSCD模型的研究中極少提及模型的制作成功率，而這一指標對研究者選擇動物模型，提高研究效率有重要意義。本研究的結果提示堿燒傷誘導LSCD模型是比較可靠的方法(鼠完全性LSCD的成功率及兔部分性LSCD的成功率分別是92%和100%)。盡管兩種方法誘導LSCD模型的成功率差異沒有統計學意義，相對于小鼠完全性LSCD，兔部分性LSCD具有成功率高、易于暴露病變區域進行觀察記錄的優點，因此可能具有更高的可重復性，有利于不同研究者之間的結果比較和客觀評價，是一種比較好的LSCD研究動物模型。剪除第三眼瞼使這種部分性LSCD兔動物模型更易于被觀察和記錄。