血清PDGF-BB作為糖尿病視網膜病變生物標志物的研究

陳 冉, 王應利, 周玉梅, 陶 俊, 靳揚揚

0引言

我國2013年糖尿病的發病率為11.6%，糖尿病患者1.139億，是世界糖尿病患者最多的國家[1]。我國DR、NPDR和PDR在糖尿病人群中的發病率分別是23.0%、19.1%和2.8%，且DR的患病率還在逐年增加，致盲率也逐年升高，因此制定DR的篩查和治療方案成為當務之急[2]。很多生物標志物參與了DR的發生和進展，傳統的標記物有血糖、血壓、血脂、體質量指數、氧化應激等相關因子，更多的新型標記物有糖基化終產物、炎性因子、血管生成因子、血管調節因子等[3-4]。PDGF-BB因其在視網膜或脈絡膜新生血管中的作用日益受到重視，它能夠促進視網膜內皮祖細胞增殖、分化和遷移，加強對周細胞的募集，誘導血管平滑肌細胞的增殖、移行等影響視網膜新生血管的成熟[5]。但目前PDGF-BB與糖尿病視網膜病變是否直接相關少見報道。本研究測定血清中PDGF-BB的質量濃度，觀察其與2型糖尿病患者DR的相關關系，探索它能否作為DR的生物標記物。

圖1 NPDR患者，張某某，女，56歲，血清PDGF-BB濃度：471.385pg/mL A、B：分別示右、左眼彩色眼底圖；C、D：分別示右、左眼FFA圖，可見微動脈瘤及毛細血管滲漏；E、F：分別示右、左眼OCT圖，未見黃斑水腫。

圖2 PDR患者，李某某，男，64歲，血清PDGF-BB濃度：594.0684pg/mL A、B：分別示右、左眼彩色眼底圖，可見全視網膜點片狀出血及黃白色硬性滲出；C、D：分別示右、左眼FFA圖，可見后極部微動脈瘤、無灌注區、視盤新生血管、視網膜新生血管；E、F：分別示右、左眼OCT圖，可見黃斑水腫及硬性滲出。

1對象和方法

1.1對象納入2017-11/2018-10于應急總醫院就診的2型糖尿病患者75例，健康體檢者75例。納入標準：(1)符合2010年美國糖尿病協會(ADA)頒布的糖尿病診斷標準的2型糖尿病患者；(2)檢查時配合良好；(3)所得OCT、彩色眼底照相及眼底熒光血管造影圖像清晰。排除標準：(1)存在除高血壓、糖尿病以外的其他系統疾病者(患者通過心電圖、超聲心動圖、胸片、腹部B超等排除系統病變)；(2)有內眼手術史及視網膜激光光凝治療史；(3)伴有青光眼、虹睫炎等其它嚴重眼部疾病者；(4)具有可能影響黃斑厚度的其他眼底病者；(5)資料不全或不能配合檢查者。本項研究遵循《赫爾辛基宣言》，受檢者均簽署知情同意書，并通過我院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1采集血清標本抽取清晨空腹靜脈血5mL，其中3mL靜脈血用于測定空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋自(HDL)等生化指標，另2mL靜脈血以3 000r/min的轉速離心10min后，取其血清置于-50℃冰箱中凍存。

1.2.2分組將患者根據2014年《我國糖尿病視網膜病變臨床診療指南》DR的臨床分期標準[2]進行分組：(1)患2型糖尿病但無糖尿病視網膜病變者組(NDR組)25例；(2)非增殖性糖尿病視網膜病變組(NPDR組)25例；(3)增殖性糖尿病視網膜病變組(PDR組)25例。對照組選取同期應急總醫院的健康體檢者75例。四組研究對象近6mo內無感染性疾病史，且性別、年齡、體質量指數(BMI)相匹配。

1.2.3 PDGF-BB質量濃度測定采用人PDGF-BB ELISA檢測試劑盒，ELISA法對血清中的PDGF-BB質量濃度進行測定。取出血清標本，室溫下靜置解凍，30min內檢測，根據試劑盒說明書操作，酶標儀450nm處讀數，測定各孔吸光度(OD)值，根據定比稀釋標準品的OD值繪制標準曲線，根據樣品OD值和標準曲線，計算出標本中PDGF-BB的質量濃度。

1.2.4數據收集由同一組經驗豐富的醫生收集數據，包括最佳矯正視力(BCVA)、眼底檢查，彩色眼底照相，OCT及眼底熒光血管造影檢查。由OCT多功能影像診斷平臺掃描生成黃斑區視網膜厚度地形圖，并測量以黃斑中心為圓心，直徑4mm圓形范圍內的9個區域視網膜厚度值，取其平均值為黃斑中心厚度(central subfield macular thickness，CSMT)[6]。

統計學分析：使用統計學軟件SPSS24.0進行數據分析，經檢驗所測數據均符合正態分布。計量資料以均數±標準差表達。血清中PDGF-BB濃度與高血壓、糖尿病病程、各項生化指標相關性用多元線性回歸分析。各組間血清中PDGF-BB濃度的比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩組間比較采用LSD-t法進行多重比較。各組PDGF-BB濃度與CSMT的相關性采用Pearson相關性分析,雙側P<0.05則差異有統計學意義。

2結果

2.1研究對象的一般資料研究對象近15d內均未患感染性疾病，按前述方法分為四組。NPDR組和PDR組典型病例圖片見圖1、2。四組研究對象年齡、性別、BMI相匹配，基本情況見表1。

2.2各組生化指標及病程的比較糖尿病組與對照組FPG、HbA1c、TC、TG、LDL、HDL、高血壓病程、糖尿病病程的水平比較見表2。各組間TC、TG、HDL、LDL、高血壓病程差異均無統計學意義(P>0.05)。NDR組、NPDR組、PDR組的糖尿病病程、FPG、HbA1c均高于對照組(P<0.05)，且NDR組

表1 各組研究對象基本情況

表2 各組生化指標及病程的比較

表3 各組血清PDGF-BB濃度與CSMT的相關性分析

2.3血清PDGF-BB濃度與各項指標相關性分析血清PDGF-BB濃度與各項指標的多元回歸分析模型結果可信(R2=0.656)，結果顯示：血清PDGF-BB濃度與FPG、TG、糖尿病病程有相關性(P=0.045、0.002、<0.01)，與HbA1c、TC、高血壓病程、HDL、LDL均無相關性(P=0.800、0.626、0.571、0.736、0.342)。

2.4各組血清PDGF-BB濃度比較對照組、NDR組、NPDR組、PDR組四組血清PDGF-BB濃度分別為400.28±44.55、409.65±50.37、535.67±69.21、551.60±103.46pg/mL，各組間差異有統計學意義(F=14.259，P<0.01)。進一步采用LSD-t多重比較發現，對照組和NDR組PDGF-BB濃度比較差異無統計學意義(t=0.288,P=0.774)，NPDR組和PDR組PDGF-BB濃度比較差異無統計學意義(t=0.569,P=0.572)。對照組和NPDR組PDGF-BB濃度比較差異有統計學意義(t=4.28,P<0.01)。對照組和PDR組PDGF-BB濃度比較差異有統計學意義(t=4.59,P<0.01)。NDR組和NPDR組PDGF-BB濃度比較差異有統計學意義(t=4.61,P<0.01)。NDR組和PDR組PDGF-BB濃度比較差異有統計學意義(t=4.91,P<0.01)。血清PDGF-BB濃度比較：PDR組、NPDR組>NDR組、對照組。

2.5各組血清中PDGF-BB濃度與CSMT的相關性分析各組血清PDGF-BB濃度與CSMT采用Pearson相關性分析顯示：PDR組血清PDGF-BB濃度與CSMT存在相關性(r=0.613，P=0.017)，對照組、NDR組、NPDR組血清PDGF-BB濃度與CSMT不存在相關性(r=0.013、0.051、0.062，P=0.732、0.771、0.108)，見表3。

3討論

本研究檢測了2型糖尿病患者不同DR病程及對照組血清PDGF-BB水平，發現四組血清PDGF-BB濃度組間存在顯著性差異(F=14.259，P<0.01)。PDR患者血清中PDGF-BB水平高于NDR患者及對照組，且黃斑水腫程度與PDGF-BB水平正相關。說明隨著DR疾病程度的加重，血清PDGF-BB水平升高，血清PDGF-BB水平或許可以作為反映DR程度的血清標記物。既往動物實驗表明，2型糖尿病的遺傳模型Goto-Kakizaki(GK)大鼠在7mo時血清中PDGF-BB含量開始升高，說明其可能參與了GK大鼠糖尿病的發生發展[7]。而易如海等[8]在大鼠DR模型中的研究發現，大鼠在NDR期視網膜PDGF-BB的表達已顯著增加，隨著病程延長PDGF-BB的表達進一步增加，和我們的結果略有區別。可能是因為DM早期血-視網膜屏障尚未破壞，視網膜中的PDGF-BB尚未影響到血清。Anna等[9]在研究中發現NPDR患者玻璃體液中的PDGF-BB含量較非糖尿病對照組顯著下調，而我們的結果顯示NPDR患者血清中PDGF-BB濃度高于正常對照組，這可能是因為隨著病情的進展，NPDR期患者的血-視網膜屏障破壞，NDR期形成的PDGF-BB進入血液中，導致血清中PDGF-BB濃度增加，但NPDR期由于高血糖應激，視網膜PDGF-B表達受到抑制，玻璃體液中的PDGF-BB含量減少。Annie等發現PDGF-BB在PDR患者的玻璃體中持續增加，與我們的結果一致[10]。可能因PDGF-BB表達在NPDR期被抑制，使其對周細胞保護和調控作用下降，導致周細胞增殖減少而凋亡增加，加劇了視網膜微血管損傷，隨著病程由NPDR向PDR進展，機體對高血糖的耐受，PDGF-BB的表達代償性增加，進而形成視網膜新生血管。因此可以推斷，PDGF-BB在NPDR和PDR階段可能起不同作用。

本項研究中，血清PDGF-BB濃度僅與PDR組黃斑厚度相關，與NPDR組黃斑厚度無相關性。我們知道，隨著DR病情的加重，進入增殖期的患者發生黃斑水腫的機率更大，程度更重。最近，Cacciamani等[11]通過蛋白芯片、western blot、ELISA等方法檢測了30例糖尿病黃斑水腫患者玻璃體液中眾多與炎癥和血管生成有關的生物標記物，發現除了眾所周知的VEGF外，還有骨橋蛋白、白介素-6等生物標記物水平與黃斑水腫程度相關。我們的研究是對PDGF-BB作為糖尿病黃斑水腫的生物標記物，還需要多中心大樣本檢測。既往的試驗是用OCT掃描生成黃斑視網膜地形圖，取黃斑中心為圓心，直徑1mm圓形范圍內的128個視網膜厚度值為CSMT[6]，本試驗將測量范圍擴大到直徑4mm圓形范圍內，并取黃斑區視網膜地形圖中9個區域視網膜平均厚度值為CSMT，使結果更加準確。本試驗觀察到血清中PDGF-BB濃度與FPG具有相關性，以往的研究也已證實，體內高血糖水平會通過激活蛋白激酶C信號通路促進血管內皮細胞中PDGF-BB和PDGFR-β的表達[12]。本研究發現血清中PDGF-BB濃度與TG具有相關性，目前普遍認為嚴重的脂質代謝異常，不僅直接損傷細胞，還會導致PDGF-BB的高表達[13]，與本試驗相符。Sahar等發現糖尿病患者尿PDGF-BB與糖尿病病程正相關[12]，我們的結果顯示患者血清中PDGF-BB濃度與糖尿病病程具有相關性，可能是由于隨著糖尿病病程的遷延，患者血清中PDGF-BB含量增加導致隨尿液排出的PDGF-BB含量增加。本研究發現血清中PDGF-BB水平與HbA1c、TC、HDL、LDL、高血壓病程無相關性，與Yang等[14]的研究結果一致。

綜上所述，隨著糖尿病病程的發展，患者從發生DR開始血清中PDGF-BB濃度明顯升高，當進入增殖期時患者血清中PDGF-BB濃度與黃斑水腫存在明顯正相關，提示PDGF-BB可以做為監測糖尿病病程進展的生物標志物。但本試驗為橫斷面研究，無法建立因果聯系，且DM患者血清中PDGF-BB濃度受全身因素影響較大，與DR的關聯性需要增大樣本量進一步確認，并且需要深入探索DM患者血清中PDGF-BB的來源、影響因素以及對DR病情發展的作用。