miR-510通過打靶c-MYC抑制肝細胞癌的發展

王子文，劉兆玉

（中國醫科大學附屬盛京醫院放射科，沈陽 110004）

肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 是肝臟最常見的原發性腫瘤，是全世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一。目前手術切除和肝臟移植是治療HCC最為有效的方式，但這僅限于早期腫瘤，而且肝臟移植受肝捐贈者的限制導致可操作性不強［1-2］。針對RAF/VEGFR/PDGFR通路的多激酶抑制劑Sorafenib是目前美國食品和藥物管理局 （Food and Drug Administration，FDA） 批準的唯一用于肝癌治療的藥物，然而它在改善患者存活時間方面的功效還比較有限［3］。因此，尋找新的能夠識別HCC的治療靶點極其必要。

微小RNA （microRNA，miRNA） 是進化保守的非編碼小RNA，通過與靶基因的3’UTR區結合，導致mRNA的降解或mRNA翻譯的抑制，從而調控基因的轉錄和翻譯。miRNA已被證明是多種腫瘤的關鍵調節因子，根據其靶基因的生物學功能，可以發揮致癌基因或抑癌基因的作用［4］。研究表明，多種miRNA在肝癌標本中存在異常表達，并通過調節細胞增殖、生存和侵襲性等調節肝細胞癌的進程。因此，推測某些miRNA可能成為治療HCC的潛在的新靶點［5-6］。miR-510已經被證明在多種腫瘤中存在異常表達的現象，但是目前尚未見其在HCC中表達情況的報道。

c-MYC癌基因的過度表達是HCC中的常見事件，研究證明c-MYC可以通過調節AKT/mTOR和RAS/MAPK等信號通路促進HCC的進程。本研究擬探討miR-510在HCC中的表達情況及其與c-MYC的關系，旨在研究miR-510對HCC的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HCC衍生內皮細胞HepG2 （中科院典藏細胞庫）；DMEM培養基、胎牛血清 （天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；miR-510擬似物、miR-510抑制物 （廣州銳博生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒、臺盼藍 ［生工生物工程 （上海） 股份有限公司］；c-MYC、GAPDH及相應二抗 （Santa Cruz Biotechnology公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 標本來源：選取我院由2014年至2018年收治的30位HCC患者作為研究對象。患者年齡47～73歲，平均60.12歲，男21例，女性9例。在獲得患者知情同意后，留取肝癌組織及癌旁組織，并保存于液氮中備用。

1.2.2 芯片篩選：委托沈陽匯佰生物有限公司對肝癌組織及癌旁組織進行miRNA分析。采用Mynasy試劑盒 （QiAGEN，上海尚耀生物技術有限公司） 從冷凍組織中提取總RNA，用于NTROR miRNA平臺檢測。所有樣品制備和雜交均按照說明書進行操作。

1.2.3 實時PCR：用Qiazol reagent和Mynasi-Mini試劑盒 （QiAGEN，上海尚耀生物技術有限公司） 從冷凍組織中分離總RNA。使用TaqMan microRNA反轉錄試劑盒 （QiAGEN，上海尚耀生物技術有限公司） 合成特定miRNA的cDNA，并進行實時PCR。miR-510的正向引物序列為5’-CTTCCATACTCAGGAGAGTG GC-3’，反向引物序列為5’-TATCGTTGTACTCCAGA CCAAGAC-3’。U6用于內參對照，正向引物5’-CG CGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物5’-AC GCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。c-MYC正向引物5’-TGCTGCCAAGAGGGTCAAGT-3’，反向引物5’-TC AGCCAAGGTTGTG-3’；GAPDH正向引物5’-CGGAG TCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物5’-AGCCT TCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。反應條件為95 ℃10 min，95 ℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s 40個循環。所有實驗重復3次。

1.2.4 細胞培養：用含10 %胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、5%CO2條件下培養人HCC細胞系HepG2。

1.2.5 熒光素酶報告實驗：在96孔板中培養HepG2細胞至貼壁后，使用lipo2000轉染50 ng pluc-3’UTR（c-MYC WT，即野生型，及c-MYC MUT，即突變了c-MYC與miR-510結合位點的突變型）、10 ng Renilla luciferase plasmid和5 pmol miR-510擬似物或陰性對照轉染。孵育48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統 （PROMEGA，北京索萊寶科技有限公司） 檢測熒光素酶活性。

1.2.6 CCK-8實驗：在96孔板中接種1×103個轉染細胞，分別于接種后0、12、24、36和48 h添加CCK-8 （10 μ L/孔）。37 ℃孵育2 h后，在450 nm處檢測吸光度。

1.2.7 Transwell實驗：在24孔板中轉染細胞24 h后，將5×104個細胞懸浮在200 μ L無血清DMEM培養基中，接種至Transwell上室中。加入600 μ L含有10%胎牛血清的DMEM。在5%CO2、37 ℃孵箱中孵育8 h后，用含有0.4%臺盼藍和20%甲醇的染料溶液染色固定細胞，200倍顯微鏡下觀察。

1.2.8 Western blotting：細胞轉染24 h后，裂解細胞，提取蛋白，用10% SDS-PAGE分離蛋白，轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，c-MYC （1∶1 000）或GAPDH （1∶10 000） 抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，對應二抗室溫孵育2 h，再次洗膜，ECL發光。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。采用t檢驗，比較肝癌組織與癌旁組織的miRNA分布情況。P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-510在HCC中低表達

芯片分析結果顯示，有10種miRNA在HCC中異常表達，其中miR-510在癌組織中的表達遠遠低于在癌旁組織中的表達，下降約76.27倍，差異有統計學意義 （P ＜ 0.001），見圖1。

圖1 多種miRNA在肝細胞癌與癌旁組織中存在差異性表達Fig.1 Differential expression of miRNAs in hepatocellular carcinoma and adjacent tissue

實時PCR結果顯示，miR-510的表達在HCC癌組織中顯著下調，與對照組相比差異有統計學意義 （P =0.019），見圖2。

2.2 miR-510靶向作用于c-MYC

圖2 miR-510在HCC癌組織與癌旁組織中的表達Fig.2 The expression of miR-510 in hepatocellular carcinoma and adjacent tissue

miRDB軟件預測分析發現，miR-510與c-MYC具有結合位點。報告基因實驗指出，miR-510能夠抑制c-MYC的活性，但是如果突變了兩者的結合位點，則該抑制作用消失，結果見圖3。

Western blotting結果顯示，HepG2細胞中miR-510過表達可以顯著抑制c-MYC的表達，而當miR-510受到抑制后c-MYC的表達水平上升，見圖4。

2.3 miR-510對HepG2增殖和遷移的影響

MTT結果顯示，miR-510過表達后，HepG2細胞的增殖受到顯著抑制；反之，miR-510表達下調則能夠促進HepG2細胞的增殖，見圖5。

圖3 miR-510可以直接打靶c-MYCFig.3 miR-510 can directly target c-MYC

圖4 Western blotting檢測miR-510對HepG2細胞中c-MYC蛋白表達的影響Fig.4 The expression of c-MYC in HepG2 after treated by miR-510 or miR-510 inhibitor detected by Western blotting

Transwell結 果 顯 示，miR-510過 表 達 可 抑 制HepG2的遷移，miR-510表達下調則能促進HepG2細胞的遷移，見圖6。

3 討論

越來越多的證據表明，各種腫瘤抑制因子的丟失和細胞生長信號的異常調控，如ERK/MAPK、Wnt/β-catenin和c-MYC/Akt/ras等通路的異常，都與肝腫瘤發生有關［7-8］，但HCC的分子發病機制目前仍知之甚少。

近年來，miRNA的異常調控已被認為與肝癌發生發展密切相關。在肝癌中已經發現多種miRNA存在異常表達的現象，這些miRNA調控的靶基因可能是致癌基因或者抑癌基因，因此不同miRNA在肝癌中發揮的作用也不盡相同［9］。miR-29、miR-21和miR-221可以通過影響肝癌細胞中癌基因的表達，調節某些信號通路的過度激活，從而參與調節腫瘤細胞的生長、凋亡、遷移和侵襲［10-11］。本研究通過基因芯片技術分析了HCC與癌旁組織中miRNA的表達情況，結果發現8個差異性表達明顯的miRNA，其中miR-510在HCC中下調的現象最為顯著。

圖5 miR-510對HepG2細胞增殖的影響Fig.5 Effect of miR-510 on the proliferation of HepG2 cells

圖6 miR-510對HepG2細胞遷移的影響 ×200Fig.6 Effect of miR-510 on migration of HepG2 ×200

研究［12］發現miR-510可以抑制腎細胞癌及胃癌的發生發展。雖然在乳腺癌中miR-510發揮癌基因還是抑癌基因的作用目前仍存在爭議［13］。但是本研究在30對肝癌和癌旁組織中發現，miR-510的下調顯著，而且miR-510可以與癌基因c-MYC的3’UTR區域靶向結合，因此推斷miR-510在HCC中可能發揮抑癌基因的作用。

本研究發現，miR-510在肝癌組織中的表達低于癌旁組織，且miR-510與c-MYC具有結合位點。在HCC細胞中miR-510可以通過靶向作用抑制c-MYC的生物學活性與蛋白表達。本研究還發現，miR-510過表達可以發揮抑制HCC增殖和遷移的作用，而當miR-510表達下調時，肝癌細胞的增殖和遷移能力則得到促進。

本研究通過生物學軟件預測發現，miR-510可以打靶HCC中高表達的c-MYC，且miR-510的表達與c-MYC的表達呈負相關。

本研究分別通過熒光素酶報告基因實驗和Western blotting實驗證明了miR-510過表達可以抑制c-MYC的表達，當miR-510表達下調時，c-MYC的表達水平增高。

c-MYC在HCC的生長與遷移中發揮重要作用，miR-510也被證明可以通過影響多種信號通路的轉導作用抑制多種腫瘤細胞的生長和遷移。本研究隨后在HepG2細胞中分別過表達miR-510或抑制miR-510表達，并通過MTT和Transwell實驗檢測了miR-510對于細胞增殖和遷移的影響。結果表明，miR-510可以抑制HepG2的增殖和遷移。

綜上所述，本研究發現miR-510可以通過抑制c-MYC蛋白的表達來實現抑制HCC細胞增殖和遷移的作用，為HCC的治療提供了新的方向。