采血后標本存放時間及溫度對血漿游離DNA含量檢測結果的影響

李嘉，張玲 ，李妍 ，穆潤清

（中國醫科大學附屬第一醫院 1. 門診采血中心；2. 腫瘤研究所生物治療室；3. 檢驗科，沈陽 110001）

早在1948年，學者MANDEL等［1］就報道了血漿中游離DNA （cell-free DNA，cfDNA） 的存在。由于其含量較少，且大多為小分子片段DNA［2］，提取較困難，在提取過程中常會丟失一部分DNA，導致檢驗的相對靈敏度降低，影響實驗及臨床結果的真實性，也由此限制了血漿cfDNA在臨床診斷中的應用。最近的研究顯示，腫瘤患者血漿中cfDNA的含量顯著高于正常健康人群血漿中的含量，且檢測出的突變基因可用于指導腫瘤的靶向治療。關于在獲取腫瘤患者的血液樣本后，血液存放溫度和存放時間對cfDNA檢測結果是否有影響目前尚未明確。本研究擬檢測采血后不同存放時間及溫度下血漿中cfDNA的含量，并比較其提取效率，探討最佳的分離處理時間，為臨床上提高分離提取cfDNA的效率提供正確的指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DNA提取試劑盒 （QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，德國QIAGEN公司） 、DNA濃度檢測試劑盒（中國上海晶抗生物公司） 。DNA濃度檢測儀 （Qubit，美國Invitrogen公司） 。

1.2 方法

1.2.1 采集血液標本：血液樣本采自50例健康志愿者，其中男30例，女20例，年齡25～65歲，平均年齡43歲。抽取空腹外周靜脈血至EDTA抗凝采血管 （5 mL/管，7管/人） ，然后將其分別置于4 ℃、25 ℃，并分別存放2 h、6 h、24 h，以備后續實驗。

1.2.2 提取cfDNA：取不同存放時間及存放溫度的全血樣本5 mL，室溫3 000 r/min離心15 min。將離心后的上清液移至新的離心管中，再經16 000 r/min、室溫條件下離心10 min，將離心后的上清液移至新的離心管中，獲得血漿成分，備用。

1.2.3 檢測血漿中cfDNA含量：按照DNA提取試劑盒說明書進行操作，獲得cfDNA，并置于冰上，立即行cfDNA濃度測定。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。各組之間的差異性采用單因素方差分析進行比較。P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

檢測不同時間、不同存放溫度下各組血液標本中cfDNA的濃度，結果顯示，4 ℃下，存放2 h、6 h、24 h時，cfDNA的濃度均低于采血后立即檢測的結果，且6 h與24 h的檢測結果比較，差異也有統計學意義（P < 0.05） ；25 ℃ （室溫） 下，2 h和6 h的cfDNA濃度均低于0 h的濃度，差異均有統計學意義 （均P < 0.05） ，但24 h cfDNA濃度卻高于0 h，差異有統計學意義（P < 0.05） 。同一時間段、不同溫度下的檢測結果顯示，2 h時差異無統計學意義 （P > 0.05） ，6 h和24 h時，則均有統計學意義 （P < 0.05） 。見表1。

表1 不同時間和溫度下cfDNA濃度比較 （μ g/μ L）

3 討論

1948年法國學者首次發現了人類血液中存在cfDNA［1］。在多種疾病狀態下，患者的血漿中都可以檢測到cfDNA含量顯著升高，因此，認為血漿中cfDNA是一種很有前景的疾病診斷分子標志物，且具有提取樣本方便等優點。目前，關于cfDNA的研究主要集中在產前診斷［2-3］、腫瘤的早期診斷與預后判斷［4-5］及感染性疾病［6-7］等領域。在疾病狀態或應激條件下，cfDNA的濃度顯著升高。有學者對腫瘤患者血漿中的cfDNA進行研究發現，它具有腫瘤細胞DNA的一些特征，因而認為腫瘤患者血漿中游離的DNA可能來源于脫落的腫瘤細胞、腫瘤的凋亡細胞和壞死細胞；另有學者［8］則認為cfDNA主要來源于活細胞，特別是增殖旺盛的細胞。血液中cfDNA的濃度升高不僅見于各種腫瘤患者、孕婦等細胞增殖旺盛的人群，各種老年性疾病，如心肌梗死、中風等患者的血漿中cfDNA的濃度也顯著升高［9］。

由于cfDNA含量較少，提取難度大，且提取過程中存在部分丟失，存放時間長短及存放溫度等都會影響cfDNA的提取量。研究者對血液中cfDNA的正常參考值范圍進行了檢測，檢測的樣本多來自正常健康人，可能由于實驗樣本數量的差異及樣本處理和檢測方法的差異，導致各研究組的結果之間也存在很大的差異。ILOEJE等［10］采集了16例健康人的外周血，利用酚-氯仿法提取血漿中的cfDNA，結果顯示其含量約為 （27.6±6.91） μg/mL；KOCSIS等［11］利用QIAamp試劑盒提取外周血血漿中的cfDNA，檢測其含量平均值約為1.6 μg/mL；有研究［12-14］顯示，cfDNA的含量均<15 ng/mL。然而，由于血漿中cfDNA的提取難度較大，無論用何種方法提取都會存在一定的蛋白或多糖污染，影響DNA純度值。應用QIAamp試劑盒所提取的血漿cfDNA的純度值OD260/OD280為1.24～1.76，也未達到1.8～2.0這一理想區間。

要利用血漿cfDNA所提供的信息來進行臨床診斷及指導臨床治療，必須明確cfDNA的來源及其濃度變化的機制。研究［15］認為，血漿中cfDNA的半衰期很短，獲得血液樣本后應立即進行離心處理；而ANKER等［16］則認為，血漿中的cfDNA并非單獨存在，而是與某種組蛋白相結合，以復合物的形式存在于血漿中，因此可以耐受多種酶的降解。

本研究檢測了不同存放時間及不同存放溫度下，血漿DNA濃度的變化，結果顯示，4 ℃下存放2 h、6 h、24 h時，cfDNA的濃度均低于采血后立即檢測的結果；25 ℃ （室溫） 下存放2 h和6 h的cfDNA濃度均低于采血后立即檢測的濃度，但24 h時的濃度卻高于采血后立即檢測，差異有統計學意義 （P < 0.05） 。同一時間段，不同溫度下的檢測結果顯示，2 h時，4 ℃與25 ℃檢測結果比較，差異無統計學意義 （P >0.05） ，6 h和24 h時卻均有統計學差異 （P < 0.05） 。分析其原因可能是由于血液存放時間過長，血液釋放降解酶，血漿中cfDNA極易被酶所降解，但存放24 h后，cfDNA濃度反而增高，也許是由于血液存放時間過長導致一部分血細胞破碎，破碎的血細胞可釋放出一定量的DNA，而這部分DNA可能與血漿中原來存在的cfDNA共同導致檢測結果升高。但這種情況下分析出來的結果可能會影響準確性及臨床相關疾病的診斷與分析。

綜上所述，不論是實驗研究還是臨床診斷，檢測cfDNA都應盡量在獲得血液標本后立即進行分離，采血2 h內檢測可以不考慮存放溫度的影響。不能立即檢測者則可以先分離血漿后保存在-80 ℃冰箱中備用，來抑制降解酶的活性，保證血漿中cfDNA穩定，以防延長血液分離時間導致血漿cfDNA降解和細胞破碎釋放DNA，影響后續檢測結果。