SIAH1核異位表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

蔡存?zhèn)ィ瑴劓骆拢顣匝啵瑥堺惸?/p>

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院病理科，沈陽 110042； 2. 浙江省舟山醫(yī)院病理診斷中心，浙江 舟山 316021）

目前，乳腺癌發(fā)病率已躍居我國女性惡性腫瘤首位［1］。乳腺癌發(fā)病受多種因素 （遺傳和環(huán)境因素等） 影響。乳腺癌細(xì)胞具有異常增殖、分化程度低、侵襲能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移發(fā)生早和細(xì)胞凋亡減少等特征，其中凋亡機(jī)制異常認(rèn)為與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［2］。SIAH1 （seven in absentia homologue-1） 含有環(huán)指結(jié)構(gòu)，具有E3泛素連接酶活性，參與泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的特定蛋白質(zhì)降解。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為SIAH1可介導(dǎo)包括自身在內(nèi)的多種目標(biāo)蛋白的泛素-蛋白酶體降解過程［3］。近年來研究［4-10］發(fā)現(xiàn)SIAH1亦與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，但具體作用及機(jī)制尚不清楚。

S-亞硝基谷胱甘肽 （S-nitrosoglutathione，GSNO）是機(jī)體內(nèi)源性一氧化氮供體，高濃度GSNO會對機(jī)體產(chǎn)生毒性。GSNO使帶有游離巰基的蛋白發(fā)生S-亞硝基化修飾。研究［11］發(fā)現(xiàn)GSNO可以使細(xì)胞中甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 發(fā)生S-亞硝基化，S-亞硝基化的GAPDH可以和SIAH1結(jié)合，使SIAH1入核選擇性地降解目標(biāo)蛋白。

前期研究［12］發(fā)現(xiàn)單純性增生乳腺組織發(fā)展為浸潤性癌的過程中，SIAH1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)逐漸降低，而在細(xì)胞核中表達(dá)逐漸升高，出現(xiàn)明顯的核內(nèi)蓄積趨勢。同時(shí)前期研究［13］表明細(xì)胞質(zhì)內(nèi)SIAH1可通過激活MAPK/JNK/c-jun通路促進(jìn)Bim mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。本研究探討乳腺癌中SIAH1蛋白細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭現(xiàn)象的原因，進(jìn)一步觀察SIAH1核異位后對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

收集浙江省舟山醫(yī)院病理科2014年至2015年40例原發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌手術(shù)切除石蠟標(biāo)本，患者年齡為33～76歲 （中位年齡49歲），所有患者術(shù)前均未接受放化療，所有病理資料均由2名高級職稱病理醫(yī)師聯(lián)合診斷。本研究及所有標(biāo)本使用經(jīng)舟山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。

主要試劑包括S-P免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒 （DAB-0031） （中國福州邁新生物技術(shù)公司）；鼠抗人SIAH1抗體 （美國Santa Cruz公司），兔抗人Bim抗體 （美國Santa Cruz公司），β-actin抗體 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；SIAH1 siRNA （美國Santa Cruz公司）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清 （美國GIBCO公司）； Lipofectamine 2000、核蛋白提取試劑盒 （美國Invitrogen公司） 。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定：標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μ m切片，按照S-P免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行SIAH1 （1∶200） 免疫組織化學(xué)染色。SIAH1核異位表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及SIAH1核異位表達(dá)乳腺癌細(xì)胞模型的構(gòu)建：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。隨后在MCF-7細(xì)胞中加入100 mmol/L GSNO培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 RNA干擾：干擾片段為 SIAH1 siRNA、control siRNA和 E2F1 siRNA，按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行操作、轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.2.4 Western blotting檢測：按照相應(yīng)蛋白提取試劑盒說明書分別提取核蛋白及總蛋白，測定蛋白濃度，樣品和上樣緩沖液以4∶1混合，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗山羊抗人SIAH1 （1∶400），兔抗人Bim （1∶400），抗β-actin（1∶200） 和兔抗人LaminB1 （1∶400），4 ℃ 孵育過夜；Ⅱ抗 （酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，上海基因科技股份有限公司） 孵育2 h，TBST洗脫3次，發(fā)光顯影；應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.5 免疫熒光及共聚焦實(shí)驗(yàn)：乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中加入100 mmol/L GSNO培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置處理過蓋玻片的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞長成單層后取出蓋玻片，PBS洗2次；甲醇固定20 min，PBS洗3次，每次5 min；1%Triton 通透30 min，PBS洗3次，每次5 min；封閉30 min；一抗室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；50 μ g/mL FITC室溫避光孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；蒸餾水漂洗1次，DAPI（1∶200） 染色細(xì)胞核；滴加封片劑封片，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：收集細(xì)胞，加入300 μ L 1×binding buffer 懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC （5 μ L） 混勻后進(jìn)行Annexin V-FITC標(biāo)記，加入PI （5 μ L） 染色，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.2.7 GSNO合成：取4 mL GSH，加 2 mL HCl酸化，加入4 mL NaNO2，混合冰浴反應(yīng)20 min，加入40%NaOH調(diào)整pH至7.0左右，避光保存。產(chǎn)物稀釋200倍，PBS為陰性對照，酶標(biāo)儀測定334 nm處吸光度。計(jì)算GSNO濃度，利用PBS調(diào)整終濃度為100 mmol/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算Spearman等級相關(guān)系數(shù)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中存在SIAH1核異位表達(dá)蓄積現(xiàn)象

前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，SIAH1在正常乳腺組織中細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)，而細(xì)胞核陰性表達(dá)。在乳腺癌癌變過程中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)SIAH1蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，且與乳腺臨床病理因素 （臨床分期、分化） 顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，部分患者乳腺癌組織中 （12/40） 乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)檢測出SIAH1陽性信號，SIAH1核表達(dá)在乳腺癌組織中高于對應(yīng)的癌旁正常組織 （圖1） 。

2.2 GSNO誘導(dǎo)SIAH1核異位表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系構(gòu)建

圖1 SIAH1在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達(dá) ×200Fig.1 Expression of SIAH1 in normal breast tissue and breast cancer tissue ×200

為進(jìn)一步研究SIAH1核異位表達(dá)對細(xì)胞功能的影響，本研究構(gòu)建了GSNO誘導(dǎo)的SIAH1核異位表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系模型。激光共聚焦方法檢測結(jié)果顯示，乳腺癌MCF-7細(xì)胞中SIAH1主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)低表達(dá)；給予100 mmol/L GSNO刺激后SIAH1在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增加 （圖2） 。Western blotting檢測結(jié)果表明，與對照組 （0.31±0.01） 比較，加入50 mmol/L和100 mmol/L GSNO刺激后，SIAH1核蛋白表達(dá) （分別為1.21±0.20，1.85±0.35） 明顯增加 （均P < 0.05） 。

2.3 SIAH1核異位表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡

圖2 MCF-7乳腺癌細(xì)胞系SIAH1的表達(dá)及定位 ×200Fig.2 Expression and localization of SIAH1 in MCF-7 the breast cancer cell line ×200

流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與對照組 （11.02%±1.310%） 比較，加入100 mmol/L GSNO的實(shí)驗(yàn)組可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡 （24 h：2.02%±0.310%；48 h：1.06%±0.091%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F分別為110.317、130.113，P分別為0.038、0.041），見圖3。

在乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中應(yīng)用siRNA片段干擾SIAH1的表達(dá)，與對照組比較，SIAH1siRNA組SIAH1的核蛋白表達(dá)缺失，見圖4 。在MCF-7-SIAH1SiRNA細(xì)胞中應(yīng)用100 mmol/L GSNO處理24 h及48 h，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率結(jié)果顯示，GSNO處理組在24 h及48 h后細(xì)胞凋亡率分別為0.83%±0.338%、0.72%±0.653%，與對照組 （1.05%±0.910%） 比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （均P > 0.05），見圖5。

2.4 GSNO誘導(dǎo)SIAH1核轉(zhuǎn)位后E2F1/Bim的表達(dá)下降

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況Fig.3 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

圖4 SIAH1核蛋白表達(dá)Fig.4 SIAH1 nuclear protein expression

Western blotting檢測結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中應(yīng)用100 mmol/L GSNO刺激后，與對照組比較，SIAH1核蛋白表達(dá)增加，而E2F1和Bim蛋白表達(dá)均降低。在MCF-7細(xì)胞GSNO刺激的同時(shí)siRNA干擾E2F1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較E2F1和Bim蛋白表達(dá)均下降 （圖6） 。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況Fig.5 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

圖6 SIAH1核蛋白表達(dá)Fig.6 SIAH1 nuclear protein expression

凋亡結(jié)果顯示，與未處理組比較 （10.32%±1.110%），MCF-7細(xì)胞GSNO刺激同時(shí)siRNA干擾E2F1組細(xì)胞凋亡率 （0.82%±0.021%） 明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F = 131.063，P < 0.05），見圖7。

3 討論

YOSHIBAYAS等［14］研究發(fā)現(xiàn)，SIAH1可通過依賴β-catenin降解和不依賴β-catenin降解2條途徑共同促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。HE等［15］研究表明SIAH1可通過增強(qiáng)放射線敏感度促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。而KUROKAWA等［16］發(fā)現(xiàn)SIAH1可以降低促凋亡蛋白HIPK2穩(wěn)定性，提示其可能發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用。前期研究［12］提示SIAH1作為腫瘤抑制因子在乳腺癌癌變過程中發(fā)揮重要作用。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況Fig.7 Analysis of breast cancer cell apoptosis using flow cytometry

本研究證實(shí)SIAH1在部分乳腺癌組織中存在核表達(dá)，提示乳腺癌中存在SIAH1核異位表達(dá)蓄積現(xiàn)象。有研究［11］發(fā)現(xiàn)SIAH1具有GSNO依賴的核異位表達(dá)現(xiàn)象。本研究顯示GSNO可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中SIAH1入核，抑制SIAH1表達(dá)后這種作用消失。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明GSNO可以抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，且這一過程與SIAH1核轉(zhuǎn)位有關(guān)。因此，進(jìn)一步研究SIAH1核轉(zhuǎn)位抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，對深入了解SIAH1生物學(xué)功能具有重要的意義。

研究［17］表明轉(zhuǎn)錄因子E2F1是細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，且在肺癌細(xì)胞系中E2F1可介導(dǎo)SIAH1的調(diào)控機(jī)制，本研究結(jié)果顯示給予乳腺癌細(xì)胞GSNO刺激后，細(xì)胞核SIAH1蛋白表達(dá)增加，而E2F1和Bim蛋白表達(dá)均降低，提示GNSO誘導(dǎo)SIAH1核異位后可能降低E2F1和Bim蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步研究E2F1/Bim在SIAH1核轉(zhuǎn)位中對細(xì)胞凋亡的影響，給予乳腺癌細(xì)胞GSNO刺激的同時(shí)siRNA干擾E2F1的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明處理后的細(xì)胞早期凋亡率明顯下降，提示GNSO誘導(dǎo)SIAH核異位后抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡可能是通過下調(diào)E2F1來調(diào)控的。

綜上所述，乳腺癌組織中可出現(xiàn)SIAH1核異位現(xiàn)象。在乳腺癌細(xì)胞系中，GNSO誘導(dǎo)SIAH1核異位后可能是通過下調(diào)E2F1的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，提示SIAH1可能成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。E2F1/Bim是如何在GSNO誘導(dǎo)的SIAH1核異位表達(dá)中發(fā)揮作用，具體機(jī)制有待于今后進(jìn)一步探討。