SH3BGRL3基因過表達對NB4細胞增殖及分化的影響

宋君紅，沈樹紅

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心血液科，上海 200127）

SH3 域結(jié)合谷氨酸豐富蛋白樣蛋白3 （SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3，SH3BGRL3） 是硫氧還蛋白超基因家族的成員，基因定位于1p34.3-p35，編碼93個氨基酸。它編碼的蛋白和大腸桿菌的谷氧還蛋白 （glutaredoxin，GRX） 1很相似，是一類小型氧化還原酶。但SH3BGRL3缺乏GRX酶2個半胱氨酸殘基組成的CXXC活性結(jié)構(gòu)域，所以缺乏GRX酶活性。另外有研究［1］認為SH3BGRL3蛋白可能參與抑制腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 介導(dǎo)的細胞凋亡，所以又被叫做TNF抑制蛋白 （TIP-B1）。近期有研究［2］發(fā)現(xiàn)SH3BGRL3也是一種新的表皮生長因子受體結(jié)合伙伴，但對其確切功能知之甚少。本課題組前期研究［3］發(fā)現(xiàn)，SH3BGRL3基因及蛋白在全反式維甲酸 （all-trans retinoic acid，ATRA） 誘導(dǎo)急性早幼粒細胞白血病 （acute promyelocytic leukemia，APL） 細胞株NB4分化過程中明顯上調(diào)，而SH3BGRL3在急性髓細胞白血病細胞株HL60中也可被ATRA誘導(dǎo)上調(diào)。根據(jù)以上結(jié)果，推測SH3BGRL3基因高表達與ATRA誘導(dǎo)NB4細胞分化成熟有關(guān)。為進一步探討NB4細胞分化與SH3BGRL3基因表達之間的關(guān)系，本研究應(yīng)用含SH3BGRL3基因的慢病毒質(zhì)粒感染NB4細胞，使NB4細胞穩(wěn)定過表達SH3BGRL3基因，觀察過表達SH3BGRL3后NB4細胞在ATRA作用下分化行為的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒包裝系統(tǒng)由pLV-CXIH、psPAX2和pMD2.G這3個質(zhì)粒構(gòu)成，其中pLV-CXIH為過表達慢病毒轉(zhuǎn)移載體，而psPAX2和pMD2.G則含有病毒包裝所必須的其他元件。大腸桿菌感受態(tài)DH5 α為本實驗室保存；攜帶SH3BGRL3基因的質(zhì)粒pSG5-M-SH3BGRL3-FLAG由本課題組前期構(gòu)建完成；APL細胞株NB4細胞及293T細胞均為本實驗室保存。Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA 連接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶等均購自大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自美國Omega Bio-Tek公司；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購自日本TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基購買自美國Invitrogene公司；質(zhì)粒小抽試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；CD11b、CD54、SH3BGRL3抗體購自美國Cell Signaling公司；CCK-8購于日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表達載體pLV-CXIH-SH3BGRL3的構(gòu)建與鑒定：以本實驗室前期構(gòu)建好的含有目的基因的克隆質(zhì)粒pSG5-M-SH3BGRL3-FLAG為模板，用高保真酶體系擴增目的基因。PCR產(chǎn)物切膠純化回收，片段長度280 bp。回收產(chǎn)物用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，同時雙酶切慢病毒載體質(zhì)粒pLV-CXIH，并切膠純化回收，片段長度8 060 bp。2種膠回收產(chǎn)物用T4連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，于LB培養(yǎng)液中擴增并提取質(zhì)粒，送中國Invitrogene公司測序，確定插入序列正確。

1.2.2 慢病毒質(zhì)粒包裝：取對數(shù)生長期293T細胞，2×106/皿，種于10 cm平皿中，待細胞生長至70%時轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染體系如下：pLV-CXIH-SH3BGRL3 15 μg、psPAX2 10 μg、pMD2.G 5 μg，溶解于TE緩沖液，濃度為0.4～1 μg/μL。轉(zhuǎn)染操作參照磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。16 h后更換培養(yǎng)液，換液后48 h收集病毒上清，于冰上短期保存。空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同上。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染NB4細胞：對數(shù)生長期的NB4細胞以2×105/mL的密度接種于6孔板中，分別加入6μg/mL的聚凝胺和1 mL包含有慢病毒載體的培養(yǎng)上清，900 g離心2 h，然后去除上清，重懸于1 mL完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每天重復(fù)以上操作1次，轉(zhuǎn)染3～4 d后加Hygromycin B篩選。置于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

1.2.4 Western blotting鑒定：提取轉(zhuǎn)染SH3BGRL3（NB4-SH3） 和轉(zhuǎn)染病毒空載的 （NB4-blank） 的2組NB4細胞及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的NB4細胞蛋白作為空白對照，用BCA試劑盒進行蛋白定量，上樣量20 μg，濕式轉(zhuǎn)膜，鼠抗人SH3BGRL3單克隆抗體檢測目的基因轉(zhuǎn)染情況。

1.2.5 采用CCK-8檢測過表達SH3BGRL3對NB4細胞增殖的影響：將處于對數(shù)生長期NB4-blank、NB4-SH3細胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，密度為 （2.0～2.5） ×104/孔，分為給藥組和不給藥組。給藥組加入ATRA （終濃度1 μmol/L），孵育12、24、36、48、60及72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL孵育4～5 h，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量450 nm處各孔的吸光度值。放入培養(yǎng)箱中孵育到上述各相應(yīng)時間段。

1.2.6 過表達SH3BGRL3對NB4細胞分化的影響：將NB4-blank、NB4-SH3細胞以2×105/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，分為給藥組和不給藥組。給藥組加入ATRA （終濃度1 μmol/L）。培養(yǎng)72 h后，流式細胞儀檢測各組細胞CD11b、CD54的表達情況，并用瑞士-吉姆薩染色觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件進行。計量資料采用±s表示，多組間比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建SH3BGRL3過表達載體轉(zhuǎn)染NB4細胞后Western blotting檢測結(jié)果

SH3BGRL3慢病毒載體轉(zhuǎn)染NB4細胞后，Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SH3BGRL3基因后NB4-SH3細胞SH3BGRL3蛋白的表達明顯增高，見圖1。

圖1 構(gòu)建穩(wěn)定過表達SH3BGRL3的NB4細胞株Fig.1 Establishment of NB4 cells with stable overexpression of SH3BGRL3

2.2 SH3BGRL3基因?qū)B4細胞增殖的影響

不給藥狀態(tài)下NB4-SH3組細胞的增殖較NB4-blank組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而ATRA處理后，NB4-SH3+ATRA組細胞的增殖較NB4-blank+ATRA組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.05），見圖2。

2.3 NB4細胞轉(zhuǎn)染SH3BGRL3后對細胞分化的影響

圖2 過表達SH3BGRL3基因抑制NB4細胞增殖Fig.2 NB4 cell proliferation was significantly inhibited by overexpression of SH3BGRL3

NB4-SH3和NB4-blank細胞經(jīng)ATRA處理48 h后，NB4-SH3細胞較對照NB4-blank細胞形態(tài)上趨于成熟 （圖3）。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，ATRA處理72 h后，NB4-SH3+ATRA組細胞CD11b、CD54的表達較NB4-blank+ATRA組增加，其中CD54的差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.05） ，見圖4。

圖3 NB4細胞過表達SH3BGRL3后經(jīng)ATRA處理48 h后的形態(tài)變化 ×1 000Fig.3 Morphological changes of NB4-SH3 and NB4-blank cells treated with ATRA for 48 h ×1 000

圖4 NB4-SH3和NB4-blank細胞經(jīng)ATRA處理72 h后CD11b和CD54陽性率的比較Fig.4 Changes in CD11b and CD54 expression in NB4-blank and NB4-SH3 cells treated with ATRA for 72 h

3 討論

APL約占所有急性非淋巴細胞白血病病例的10%左右，95%以上的APL患者的白血病細胞中均含有特異的染色體易位t （15；17） （q22；q12），形成融合基因PML-RAR α與RAR α-PML，通過與維甲酸X受體 （retinoic acid X receptor，RXR） 及其他RAR α輔因子形成多聚復(fù)合體，競爭性抑制正常RAR α基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而阻遏髓系分化必需的一些基因的轉(zhuǎn)錄，并抑制細胞凋亡，造成骨髓中大量未成熟的早幼粒細胞增生［4-5］。

ATRA在藥理濃度 （10-6～10-7mol/L） 下能使PML-RAR α與核受體共抑制因子N-CoR解離，釋放轉(zhuǎn)錄抑制作用，促進維甲酸反應(yīng)基因包括多種癌基因、轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子等靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究［6］發(fā)現(xiàn)，APL細胞受維甲酸調(diào)變的基因多達169種，包括100種上調(diào)基因及69種下調(diào)基因。通過龐大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)減少APL細胞增殖，維持細胞的活性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，最終促進粒細胞分化成熟。

在ATRA誘導(dǎo)APL細胞株NB4分化成熟的過程中，SH3BGRL3是早期調(diào)變的基因。先期的研究發(fā)現(xiàn)，其mRNA水平在ATRA處理12 h后達到峰值，蛋白水平在24 h達到峰值。SH3BGRL3是一種胞質(zhì)蛋白，在NB4及多種正常組織中都有表達。目前對其功能知之甚少。一般認為，ATRA誘導(dǎo)NB4細胞12 h內(nèi)發(fā)生調(diào)變的基因?qū)覰B4細胞分化作用更重要。而SH3BGRL3基因調(diào)變與NB4細胞分化趨勢一致，所以本研究通過NB4細胞過表達SH3BGRL3基因，研究NB4-SH3的功能變化，以了解SH3BGRL3基因在NB4細胞增殖及分化成熟中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在細胞增殖方面NB4-SH3細胞增殖較NB4細胞降低，ATRA處理后這種增殖抑制效果更明顯。通過細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，SH3BGRL3增加周期的阻滯功能。細胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達SH3BGRL3后NB4細胞形態(tài)趨于成熟，通過細胞流式術(shù)檢測到NB4細胞表面成熟粒細胞免疫標記CD11b表達增加，也證實了這一點。

NB4細胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)成熟后引起一系列細胞表 面 抗 原 變 化，包 括CD11c、CD54、CD11a、CD14、CD11b、CD53、CD65、CD138等，這些抗原的變化可以作為APL治療性抗體的選擇。本研究發(fā)現(xiàn)，NB4-SH3細胞較對照NB4細胞CD54、CD11b的表達無明顯增高，但經(jīng)ATRA處理后，CD54、CD11b的表達增加。所以認為SH3BGRL3的表達能促進ATRA誘導(dǎo)NB4細胞成熟，考慮SH3BGRL3通過作用于其他伙伴基因共同促進ATRA誘導(dǎo)的NB4細胞分化成熟。ATRA治療過程中約30%的APL患者可能出現(xiàn)維甲酸綜合征，其原因為誘導(dǎo)分化后的細胞通過改變黏附分子和細胞趨化因子引起細胞及鄰近細胞的相互作用導(dǎo)致［7］。CD54分子 （ICAM-1） 在APL細胞表達低下，而ATRA和三氧化二砷能明顯誘導(dǎo)APL細胞及肺臟血管上皮CD54的表達。考慮CD54可能參與介導(dǎo)了腫瘤與基質(zhì)的黏附，從而與維甲酸綜合征的發(fā)生有關(guān)［8］。

造血細胞的分化需要啟動不同轉(zhuǎn)錄因子的表達，調(diào)節(jié)編碼細胞膜蛋白及細胞因子等基因的活性，影響細胞的生長、增殖、分化和凋亡，并伴隨細胞膜蛋白及細胞因子的變化，而這些蛋白及細胞因子的表達提供了有關(guān)預(yù)后的信息。研究發(fā)現(xiàn)，APL細胞中如果伴有TNF-α、白細胞介素-1等能提高ATRA對APL患者的治療敏感性，有利于APL細胞的分化成熟。TNF-α能下調(diào)細胞的數(shù)量，并且參與細胞的生長、增殖及存活。有研究［1］發(fā)現(xiàn)，SH3BGRL3能激活核因子-κ B信號通路，抑制TNF-α介導(dǎo)的成纖維細胞的凋亡。而在ATRA誘導(dǎo)NB4細胞分化成熟的過程中C-fos、C-jun表達增高，與核因子-κ B相關(guān)基因開啟有關(guān)。所以SH3BGRL3是否通過抑制TNF-α信號通路介導(dǎo)的細胞凋亡，促進或增強ATRA誘導(dǎo)的NB4細胞的分化成熟，有待進一步研究。