經支氣管鏡針吸活檢聯合多標志物檢測在肺癌病理分型中的應用價值

陳菁，劉旭，楊碩，羅光偉

（武漢市第一醫院呼吸內科，武漢 430022）

肺癌在男性惡性腫瘤中位居發病率和死亡率第一位，在女性中其發病率也呈逐年上升趨勢［1］。近年來雖然肺癌治療取得了較大進展，但仍存在早期診斷困難、治療效果差等問題，仍是病死率最高的腫瘤。世界衛生組織將肺癌分為4種主要病理類型，分別為腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌和小細胞癌。前三者通常統稱為非小細胞肺癌，占所有肺癌的85%，是威脅肺癌患者生存的主要組織類型，其中又以腺癌和鱗狀細胞癌常見。不同類型的肺癌治療手段差別顯著，因此對肺癌進行正確的組織學和分子病理學分型是獲得正確治療的重要前提［2-3］。

經支氣管鏡針吸活檢術 （transbronchial needle aspiration，TBNA） 或支氣管內超聲引導下的TBNA是一種新型肺癌診斷手段，其對肺癌診斷的敏感度達90%，特異度達100%。與PET-CT相比，TBNA具有更高的敏感度和特異度，已被寫入2011年國際肺癌研究協會/美國胸科學會/歐洲呼吸學會的肺癌診治指南［4］。對TBNA獲得的標本一般進行基于形態學的HE染色，判斷腫瘤的發生，但進一步判定病理分型則存在諸多限制，如細胞量少、分化程度低等。對肺癌病理組織標本進行分子病理學檢測，根據已知公認的分型標志物進行檢測，可準確地做出病理分型診斷。研究［5-6］顯示，肺腺癌和鱗狀細胞癌幾乎不重疊共表達甲狀腺轉錄因子-1 （thyroid transcription factor-1，TTF-1） 和p63；細胞角蛋白 （cytokeratin，CK）5和CK6是鱗狀細胞癌的特異性標志物［7］；CK7是腺癌的特異性標志物［8］。目前上述指標相關檢測常在術后切除病理組織上進行，不利于早期制定治療方案，亦不適用于不宜手術的患者。因此，若能結合應用TBNA與病理分型分子標志物檢測，則能很好解決2種診斷方法的不足。

本研究回顧性研究了TBNA獲得的肺腺癌和鱗狀細胞癌患者病理組織標本，通過實時PCR檢測TTF-1、p63、CK5、CK7等標志物的表達水平，以評價各指標診斷肺癌病理分型的價值和準確性，并探究聯合應用4種標志物進行綜合診斷的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例樣本

回顧性選取2015年7月至2016年12月間術后組織病理學檢查確診為肺癌的患者178例，其中男143例，女35例，平均年齡53.2 （35～77） 歲；組織學類型：鱗狀細胞癌120例，腺癌58例。

1.2 組織樣本的獲得及總RNA的提取

首先經增強CT掃描等影像學檢查，或在超聲實時引導下，獲得病變部位的準確定位信息。在支氣管鏡輔助下進行TBNA操作，利用特制的帶有可彎曲導管的穿刺針 （專利號201720265388.7），通過氣管鏡的活檢通道進入氣管內，對縱隔內腫大的淋巴結或腫塊進行穿刺，負壓抽吸獲取細胞及組織樣本。在送檢病理科后，留取剩余樣本收集于細胞凍存管中，盡快放入液氮中保存待用。

待病理組織樣本收集齊備，選取目標病理組織進行常規TRIZOL （美國Invitrogen公司） 提取RNA操作，并經紫外分光光度法定量，統一各病例RNA樣本濃度后，進行下一步檢測。

1.3 實時PCR檢測TTF-1、p63、CK7、CK5的表達水平

取上述提取的定量后總RNA，在M-MLV逆轉錄酶 （美國Invitrogen公司） 的作用下，逆轉錄合成cDNA，并以該cDNA產物為模板進行實時PCR檢測。目的基因的引物序列：TTF-1，正義5’-CGTTCTCAG TGTCTGACATCTTGA-3’，反義5’-CCTCCATGCCCA CTTTCTTG-3’；p63，正義5’-GGAAAACAATGCCCA GACTC-3’，反義5’-GCGCGTGGTCTGTGTTAAG-3’；CK7，正義5’-GTTCCATTTGCAAAGGCTGT-3’，反義5’-CAGGTGGTTACCCGAAAGA-3’；CK5，正義5’-A TCGCCACTTACCGCAAGCTGCTGGAGGG-3’，反義5’-AAACACTGCTTGTGACAACAGAG-3’；GAPDH，正 義5’-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3’，反 義5’-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3’。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35個循環。實驗重復3次，應用2-ΔΔCt法進行分析。

1.4 統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計分析。各標志物基因表達水平用±s表示；基因表達水平組間比較采用獨立樣本t檢驗；基因表達水平與病理分型的相關性采用Pearson相關分析；變量對病理分型的診斷價值采用受試者操作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線法進行分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌病理分型分子標志物表達水平

實時PCR檢測TTF-1、p63、CK7、CK5的表達水平。腺癌中各分子標志物的表達水平：TTF-1為1.732±0.243，p63為0.110±0.003，CK7為1.221±0.141，CK5為0.215±0.030；鱗狀細胞癌中各分子標志物的表達水平：TF-1為0.107±0.004，p63為1.676±0.220，CK7為0.105±0.012，CK5為1.533±0.102。與腺癌相比，鱗狀細胞癌中TTF-1 （P = 0.006）、CK7 （P = 0.012） 的表達水平顯著降低，p63 （P = 0.008）、CK5 （P = 0.025）的表達水平顯著升高。

2.2 建立多因素綜合評分（total score，TS）診斷模型

采用Pearson相關分析確定各分子標志物基因表達水平與分型的相關性 （表1）。基于各基因表達水平與肺癌病理分型的相關系數 （r），建立TS診斷模型：TS=-0.672×TTF-1+0.778×p63-0.583×CK7+0.604×CK5，TS值越大則病理分型越傾向于鱗狀細胞癌，TS值越小則病理分型越傾向于腺癌。

2.3 ROC曲線分析各指標診斷肺癌病理分型的價值

采用ROC曲線分析4種分型標志物與綜合指標TS對肺癌病理分型的診斷價值 （圖1），結果發現，TTF-1、p63、CK7、CK5表達水平診斷肺癌分型均有良好價值，但運用4個指標獲得的綜合指標TS進行病理分型診斷時，則最佳分界值的靈敏度 （0.942）和特異度 （0.841） 均最高，ROC曲線下面積亦最大（0.934），診斷價值最佳。

表1 分型標志物表達水平與肺癌病理分型的相關性分析Tab.1 Correlation between the expression of typing markers and the pathological typing of lung cancer

2.4 單因素和多因素診斷肺癌病理分型的準確性比較

圖1 ROC曲線分析各指標單獨及綜合應用判定肺癌病理分型的價值Fig.1 Diagnostic value of each marker alone or in combination for the pathological typing of lung cancer，as determined by ROC curve analysis

分析4種分型標志物及綜合指標TS對肺癌病理分型的準確性。結果發現，腺癌檢出率最高的單因素指標為TTF-1 （45/88），鱗狀細胞癌檢出率最高的單因素指標為p63 （94/120），總檢出率最高的單因素指標為p63 （76.4%）。采用χ2檢驗比較單一指標與綜合指標檢出率的情況，TS的腺癌檢出率 （P =0.040）、鱗狀細胞癌檢出率 （P = 0.013） 及總檢出率（P < 0.001） 均顯著升高。見表2。

3 討論

大部分肺癌患者在診斷時已無手術機會，需要全身化療。越來越多的證據表明，肺腺癌和肺鱗狀細胞癌治療反應明顯不同，這就推動了非小細胞肺癌精確的病理分型。如貝伐單抗禁用于鱗狀細胞癌，這種藥物增加鱗狀細胞癌患者的肺出血風險［9］。因此，肺癌分型已經成為治療的關鍵，并能夠指導個性化治療。對于無法獲得手術切除標本的患者，通過TBNA獲取病理組織則是解決病理分型問題的重要手段。而如何充分利用TBNA獲取的小標本進行分型診斷，則具有重要臨床意義。

表2 不同分型指標進行肺癌病理分型的檢出率比較Tab.2 Comparison of the accuracy of pathological typing of lung cancer with different markers

本研究選擇了TTF-1、p63、CK7、CK5等肺癌分型常見標志物，通過敏感度高、對樣本量要求小的實時PCR法［10］進行檢測，考察單因素和多因素診斷腺癌或者鱗狀細胞癌的價值。TTF-1是診斷肺腺癌敏感度較高的檢測因子，盡管在其他腫瘤也有表達，如神經內分泌腫瘤，但是都沒有在肺腺癌中表達顯著。p63是p53家族的新成員，與多種復層上皮原發性腫瘤的發生有關，在肺癌中主要在鱗狀細胞癌中表達呈陽性。CK是細胞骨架的成份之一，其中相對分子量較高的CK5、CK6主要表達在鱗狀上皮細胞及其腫瘤組織中，而相對分子量低的CK7則表達在腺上皮細胞及其腫瘤組織中。

與已有研究一致，本研究發現肺腺癌組織中TTF-1、CK7表達水平顯著增高，肺鱗癌組織中p63、CK5表達水平顯著增高。本研究應用Pe arson相關性分析，確立了各指標與肺癌分型的相關系數，建立綜合4種標志物的多因素綜合評分診斷模型TS。ROC曲線分析發現，相對于單因素診斷效果，多因素的TS具有更高的靈敏度和特異度。并且在對比診斷病理分型的準確性時，TS結果最好，總體檢出率達到90.4%，遠遠高于各個單因素的診斷準確性。

綜上所述，本研究的結果提示，利用TBNA獲取肺癌患者病理組織，并基于實時PCR法進行肺癌分型重要分子標志物TTF-1、p63、CK7、CK5等的表達水平檢測，是可行的病理診斷方法。且綜合運用各分型指標進行診斷能夠獲得更高的診斷效率，這為肺癌病理分型診斷提供了新的檢測思路。