基于ITS2條形碼鑒定酸橙類中藥材

黃玉龍，李順祥，黃林芳

(1．哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱150076; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京100193；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

2015版《中國(guó)藥典》[1]記載枳殼是蕓香科酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的未成熟干燥果實(shí)，枳實(shí)是蕓香科酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥幼果。枳殼和枳實(shí)類[2]藥材是我國(guó)常見大宗藥材，但枳殼和枳實(shí)類中藥材來源極其混亂復(fù)雜，柑橘屬很多物種都做中藥材，甚至同一物種的不同部位都是中藥材。例如，橘核、橘葉、橘絡(luò)、橘皮和果實(shí)都是藥材。柑橘屬的不同物種可以作為不同藥材，有時(shí)也作同一藥材。不同基源、不同藥材的藥效不一樣，為制藥和臨床上準(zhǔn)確使用枳實(shí)和枳殼類中藥材，需要準(zhǔn)確區(qū)分柑橘屬的不同物種。另一方面，柑橘屬很多物種都是常見大宗水果。從基因水平鑒別不同物種，也為園林水果栽培時(shí)鑒定橘類種子種苗提供一種可靠的方法。枳殼和枳實(shí)區(qū)別僅在成熟度不同，是一體二用[3]的中藥材，藥理、藥效、所含有效成分大致相同，僅從肉眼或傳統(tǒng)方法鑒別鑒橘屬種子屬于哪個(gè)物種非常困難。本實(shí)驗(yàn)從物種水平鑒定枳實(shí)和枳殼及其混偽品，且實(shí)驗(yàn)材料為酸橙及其混偽品的種子，故在此對(duì)枳實(shí)與枳殼不區(qū)分，下文統(tǒng)稱酸橙。

DNA條形碼是載入2015版《中國(guó)藥典》的中藥材分子鑒定新方法。DNA條形碼可結(jié)合現(xiàn)在非常流行的二維碼技術(shù)[4]，以期實(shí)現(xiàn)方便、快捷、智能化鑒定。ITS2[5]是Internal transcribed spacer 2(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2)的縮寫，為核糖體DNA 的5.8S rDNA 和 28SrDNA 之間的基因序列，是非編碼區(qū)基因。ITS2在物種或亞種水平有明顯的序列變異性，被選為分子進(jìn)化系統(tǒng)研究的分子標(biāo)志，ITS2 還有易擴(kuò)增、多拷貝、序列短、兩端保守利于設(shè)計(jì)引物等優(yōu)點(diǎn)。楊美青等[6]用Geneious對(duì)中藥材防己進(jìn)行ITS2序列一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)，用The ITS2 Datebase對(duì)中藥材防己進(jìn)行ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并用4sale軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)，并運(yùn)用ProfDistS軟件構(gòu)建PNJ樹，以期用ITS2鑒定中藥材防己。由文獻(xiàn)[7]可知，植物源中藥以ITS2 為主序列、psbA-trnH[8]為輔序列，動(dòng)物源中藥材以COI 為主、ITS2 為輔；可達(dá)到中藥材鑒定的簡(jiǎn)單、迅速、精確的要求，判斷結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單明了。

基于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)正品枳(酸橙)[9]CitrusaurantiumL.及其5 種常見混偽品種甜橙CitrussinensisOsbeck、枸橘PoncirustrifoldiateL.、香櫞CitruswilsoniiTanaka、枸櫞CitrusmedicaL.、青皮CitrusreticulateBlanco進(jìn)行ITS2分析，以期從基因?qū)用骅b定區(qū)分蕓香科的這6個(gè)物種。

1 儀器與試劑材料

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋(DK-S24，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國(guó))；球磨儀(Retsch MM400,Germany)；PCR儀(ABI-9700，美國(guó))；常溫高速離心機(jī)(Sigma-1-14，德國(guó))；電泳儀(DYY-8C，中國(guó))；凝膠成像處理系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))，測(cè)序儀(ABI3730XL型，Applied Biosystems Co.,USA)。

1.2 試劑材料

百泰克植物基因組DNA提取試劑盒(Bioteke Co.，China)；2×Taq PCR Master Mix(艾德萊,中國(guó))；引物(生工 生物工程股份有限公司，上海)：正向?yàn)镮TS2F:5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’,反向?yàn)镮TS3R:5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；DNA Marker(北京艾德萊生物科技有限公司，中國(guó))；其余試劑均為分析純。

研究材料包括6個(gè)物種共43份樣品，其中包括自提樣品DNA序列8份，取自原植物種子樣品、GenBank中下載的序列35份；其中實(shí)驗(yàn)樣本分為基原植物樣本、對(duì)照藥材樣本、藥材樣本、復(fù)核樣本。樣本信息詳見表1，自提樣品均經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定。對(duì)照藥材樣本(樣本號(hào):Y15031-1; JUHE0009),復(fù)核樣本由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所(樣本號(hào): JUHE0008)進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。

2 方法

2.1 總DNA 的提取

選取硅膠干燥的葉片及粒大飽滿種子，用酒精棉擦拭樣品表面，并用潔凈濾紙包好后適當(dāng)敲碎，稱取約40 mg。每份樣品分別裝入已編號(hào)的2 ml EP管并給每份加入無菌鋼珠2枚和約3%的PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)(該步操作應(yīng)注意避免交叉污染)。經(jīng)球磨儀以1 800 r/min速度研磨2 min，充分磨碎后，用700 μL預(yù)加入0.2%巰基乙醇的核分離液洗滌1～3次。使用百泰克植物基因DNA 提取試劑盒(離心柱型)提取總DNA，其余步驟均按試劑盒說明書操作。

2.2 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

PCR反應(yīng)體系為25 μL：包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL(2.5 μmol/ L)，模板DNA 2 μL，正、反向引物各1 μL，加RNase-free 水(8.5 μL) 補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序參考Chen等[5]的研究：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s;56 ℃、30 s;72 ℃、45 s(35個(gè)循環(huán))；72 ℃、10 min。凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物情況。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 樣品來源
Tab.1 Source of samples

樣品拉丁學(xué)名樣本類別 樣本編號(hào)/GenBank 登錄號(hào)酸橙C.aurantium藥材樣本AB456125#、AB456126#、KU174590#、KU174591#、KU174592#、KU535472#、KX675070#、GQ225855#、JQ990184#。甜橙C.sinensis藥材樣本對(duì)照藥材AB456120#,Y15031-1?。枸橘Poncirus trifoldiate藥材樣本復(fù)核樣本GQ434823#、MF095889#、MF349106#,JUHE0003?。香櫞C.wilsonii基原植物藥材樣本復(fù)核樣本對(duì)照藥材JUHE0001?、JUHE0004?,JUHE0005?、JUHE0006?,JUHE0008?,JUHE0009?。枸櫞C.medica藥材樣本FJ641962#、FJ641965#、FJ641967#、FJ641968#、FJ641969#、GQ434821#、GQ434836#、GQ434837#、JF421486#、KT285089#、KT285090#、KT285091#、GQ225850#。青皮C.reticulate藥材樣本KT898272#、KX270874#、KX270876#、KX270877#、KX270879#、KX270880#、KX270881#、KX270906#、KX270907#、KX675072#。

注：*來源于藥用植物研究所的樣本為“種子種苗”項(xiàng)目中取自各道地藥材產(chǎn)區(qū)；#來源自Genbank下載序列

2.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用CodonCode Aligner V 5.1.5對(duì)測(cè)序所得峰圖處理：去除引物端和低質(zhì)量區(qū)段，并進(jìn)行校對(duì)拼接，標(biāo)準(zhǔn)為無連續(xù)2個(gè)堿基質(zhì)量低于20；全部序列用ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)基于隱馬爾可夫模型 (Hidden Markov model) 去除5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段獲得ITS2序列[10]，以及預(yù)測(cè)ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行比對(duì)、變異位點(diǎn)分析、計(jì)算遺傳距離(K2P)，并利用鄰接法((Neighbor-Joining))構(gòu)建系統(tǒng)鄰接(NJ)樹；利用DNAstar 7.10軟件計(jì)算序列G+C含量；應(yīng)用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http://www.tcmbarcode.cn)鑒定各物種序列。

3 結(jié)果與分析

3.1 基于ITS2序列的物種鑒定分析

橘核共8個(gè)樣本的ITS2 序列經(jīng)PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ITS2 序列的擴(kuò)增情況，擴(kuò)增成功率為100%。測(cè)序返回?cái)?shù)據(jù)表明，測(cè)序成功率也為100%。對(duì)測(cè)序所得峰圖校對(duì)拼接處理后，全部序列的堿基質(zhì)量值幾乎均大于20，經(jīng)ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站基于隱馬爾可夫模型去除5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段注釋并獲得ITS2序列，應(yīng)用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)對(duì)ITS2序列進(jìn)行物種鑒定，確定樣本堿基ITS2序列確實(shí)為所需鑒定的目標(biāo)物種。并且依據(jù)鑒定結(jié)果中樣本序列與鑒定所得物種序列的相似性(%)、E值、分值等情況分為不同單倍型。

鑒定結(jié)果表明，單倍型(A1、A2、A3、)、B、C、D、(E1、E2)和F分別為酸橙、甜橙、枸橘、香櫞、枸櫞和青皮正品基原物種。

3.2 種內(nèi)、種間變異分析

采用MEGA 6.0軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)、變異位點(diǎn)分析以及計(jì)算遺傳距離。種內(nèi)變異位點(diǎn)情況：酸橙JQ900184的154和155位C-T互換，枸櫞GQ225850的189位T-G互換，甜橙、枸橘、香櫞和青皮無種內(nèi)變異位點(diǎn)。酸橙與其混偽品種間變異位點(diǎn)范圍為6～72均比種內(nèi)變異位點(diǎn)(0～2)多。酸橙及其混偽品的種內(nèi)K2P距離范圍為0～0.009 1，酸橙與其混偽品的種間K2P最小距離范圍為0.016 9～0.354 7，所有樣本物種種內(nèi)最大遺傳距離均小于他們與枳殼的最小遺傳距離。酸橙與其混偽品的遺傳距離區(qū)分度好，具體結(jié)果如圖1所示。利用軟件DNAstar 7.10進(jìn)行序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)并計(jì)算G+C含量，酸橙及其混偽品43個(gè)樣本的ITS2序列長(zhǎng)度范圍為231～279 bp。所有序列長(zhǎng)度都適中，都符合ITS2序列的一般長(zhǎng)度要求，而且酸橙和混偽品序列長(zhǎng)度相近，這便于序列堿基的一一對(duì)應(yīng)比對(duì)，所以實(shí)驗(yàn)比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度更高。G+C含量范圍為69.26%～72.93%。GC間有3個(gè)氫鍵，AT間只有2個(gè)氫鍵，GC含量較高，說明酸橙及其混偽品的ITS2序列種內(nèi)保守性、化學(xué)穩(wěn)定性和空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較高，說明酸橙及其混偽品的鑒定選ITS2序列具有可行性，具體結(jié)果詳見表2。

圖1 酸橙及其混偽品ITS2序列種內(nèi)種間K2P距離計(jì)算結(jié)果與變異位點(diǎn)數(shù)目Fig.1 The calculation results of the Kimura 2-Parameter (K2P) distances and number of variable sites of the ITS2 of C.aurantium and its adulterants

表2 酸橙及其混偽品的ITS2序列長(zhǎng)度及G+C含量
Tab.2 The sequence length and the G+C content of the ITS2 ofC.aurantiumand its adulterants

樣品序列長(zhǎng)度/bp平均G+C含量/%酸橙23969.80甜橙23969.36枸橘25272.93香櫞23271.55枸櫞27969.68青皮23169.26

3.3 NJ樹聚類分析

基于全體樣本的ITS2序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化聚類樹，如圖2所示。由圖2可知，青皮聚為一支，在其外圍甜橙的2個(gè)序列聚為一支，再外圍的所有酸橙(枳)序列自聚成一支，更外圍的所有枸櫞序列也自聚為一支，最外層還有枸橘和香圓的序列分別各自聚成一支，由此可看出枸橘和香圓、青皮和甜橙的物種之間親緣關(guān)系較其他物種親近一些。

由NJ樹可明顯看出，雖然酸橙及其混偽品都屬于蕓香科的物種，它們之間具有一定的親緣關(guān)系，但仍可準(zhǔn)確區(qū)分。若同時(shí)結(jié)合變異位點(diǎn)和K2P遺傳距離分析可發(fā)現(xiàn)酸橙及其混偽品基于ITS2序列可做準(zhǔn)確鑒定。

圖2 構(gòu)建的酸橙及其混偽品的NJ樹(基于ITS2序列)Fig.2 Dendrogram of C.aurantium and its adulterants constructed with ITS2 sequences using NJ method

3.4 酸橙及其混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

構(gòu)建酸橙及其混偽品部分樣本的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示。每個(gè)單倍型至多構(gòu)建1個(gè)樣本的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并對(duì)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)情況進(jìn)行討論如下，由圖可知，除圖1(a)有3個(gè)小中心環(huán)外，所有的樣本物種ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)均為1個(gè)中心環(huán)(主環(huán))接4個(gè)螺旋區(qū)(四臂)構(gòu)成，圖1(a)和圖1(b)分別為酸橙[9]Citrusaurantium的A1和A3 2個(gè)單倍型的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，這2個(gè)不同單倍型的二級(jí)結(jié)構(gòu)有細(xì)微差別，如中心圈和右上臂。圖1(c)為枸櫞Citrusmedica的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，它與酸橙的區(qū)別在于它左上臂上多一個(gè)小圈。圖1(d)為青皮Citrusreticulate的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，它與酸橙的區(qū)別在于它有一個(gè)大中心圈。圖1(e)是甜橙Citrussinensis的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，它與酸橙的區(qū)別也在于它有一個(gè)大中心圈，僅從圖中很難區(qū)分青皮和甜橙，但是由表4可知它倆的序列長(zhǎng)度不同，分別為231和239。圖1(f)是枸橘Citrustrifoldiat的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，它與酸橙的區(qū)別在于它的右上臂小圈較多。圖1(g)為香櫞Citruswilsonii的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，它與酸橙的區(qū)別在于它的右下臂小圈較小。

綜上，酸橙與其混偽品樣本ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)在中心環(huán)(主環(huán))的數(shù)目、位置，環(huán)的大小，四個(gè)螺旋區(qū)(四臂)的長(zhǎng)度，螺旋臂與主環(huán)角度這些方面有所不同，但似乎很難找出顯著區(qū)別；故酸橙與其混偽品的二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒別的方法有必要結(jié)合變異位點(diǎn)分析法、遺傳距離(K2P)法，構(gòu)建系統(tǒng)鄰接(NJ)樹法，比較序列長(zhǎng)度和G+C含量法，中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)法等方法，綜合鑒定。

圖3 酸橙及其混偽品的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 ITS2 secondary structure of Citrus aurantium L. and part of its adulterants

4 結(jié)束語(yǔ)

本文運(yùn)用ITS2成功得到了酸橙、甜橙、枸橘、香櫞、枸櫞和青皮正品基原物種的正確匹配結(jié)果。變異位點(diǎn)數(shù)和遺傳距離法也可以有效區(qū)分各物種，NJ樹可直觀地以圖的形式表現(xiàn)出酸橙及其混偽品的區(qū)別，但是酸橙及其混偽品ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)分度以肉眼不能區(qū)分。綜上，ITS2可有效鑒定酸橙及其混偽品。

因橘類變異多，所以現(xiàn)在的果農(nóng)栽培用的樹苗大多為無性繁殖的嫁接苗，但是無性繁殖也有弊端，例如，樹齡是母體的延續(xù)，易衰老，易被刮風(fēng)下雨折枝。而實(shí)生苗比較著名的只有湖南沅江和江西某地的少量成片實(shí)生苗古樹。如果ITS2推廣應(yīng)用鑒定柑橘屬的種子種苗，那么今后育種可以采用種子種苗進(jìn)行有性繁殖，從而避免無性繁殖樹齡老齡化退化等問題。

致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所姚輝研究員在實(shí)驗(yàn)中以及文章寫作中提供的幫助與指導(dǎo)。