齒瓣石豆蘭化學成分的分離及其抗腫瘤活性研究

陳小兵，黃麗蕓，許 軍，凌志杰，潘建萍，彭 紅

(1.贛南衛生健康職業學院，江西 贛州 341000；2.江西中醫藥大學 藥學院，江西 南昌 330004)

石豆蘭屬(Bulbophyllum)是蘭科(Orchidaceae)樹蘭族(Trib.Epidendreae)石豆蘭亞族(Subtrrib.Bulbophyllinae)下屬之一，大多生長在石灰巖上。其性味甘辛，具有養胃生津、祛風除濕、消腫止痛、清熱化痰、舒筋骨、涼血活血的功效[1-2]，可用于治療高熱驚風、風濕痹痛、四肢麻木、癰腫、咽痛[3]。藥用石豆蘭屬有15種，主要分布于江西、廣西、湖北、廣東、江蘇、安徽和云南，其中云南省分布最多，有12種之多。江西齒瓣石豆蘭(Bulbophyllum.levineiSchltr)主要分布于遂川、井岡山、廬山等山區。本研究對贛南地區產的齒瓣石豆蘭藥材進行了分離純化，共得到9個化合物，經波譜分析鑒定為化合物1：7-羥基-3-(4’-羥苯基)異黃酮；化合物2：槲皮素；化合物3：2-甲氧基-1-羥基苯甲醛；化合物4：6-甲氧基-7羥基-異黃酮；化合物5：鄰羥基苯甲酸；化合物6：6-甲氧基-2-(4’-甲氧基苯基)-3-羥黃酮；化合物7：棕櫚酸乙酯；化合物8：3-甲氧基-4’-羥黃酮；化合物9：4’-甲氧基-2-甲基-7-羥異黃酮。

本研究豐富了齒瓣石豆蘭的黃酮類化學成分及其抗腫瘤活性的有效成分，為進一步研究齒瓣石豆蘭的抗腫瘤活性及有效成分提供了科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀；Inova 500型核磁共振儀(TMS為內標)；Agilent 1100 Series LC/MSD 質譜儀；制備液相色譜儀為 Shimadzu LC-6AD (制備柱，YMC-Pack ODS-A)；大孔吸附樹脂HP-20(日本三菱公司)；LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20Amersham Pharmacia Biotech 公司)；反相硅膠柱(日本YMC公司)；ACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 藥材

齒瓣石豆蘭全草于2018年6月采自江西贛州，標本的性狀特征依照有關文獻[4]的描述，并由江西古漢精制中藥飲片有限公司總經理顏干明(國家二級技師)鑒定為齒瓣石豆蘭(Bulbophyllum.levineiSchltr)。憑證樣品保存于贛南衛生健康職業學院中藥標本室。

人結腸癌HT-29細胞株、人慢性白血病K562細胞株和人乳腺癌MCF-7細胞株(美國ATCC公司)。

1.3 其他試驗用品

硅膠GF254；柱色譜硅膠G(青島海洋化工有限公司，200～300目)；LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜(Amersham Pharmacia Biotech)。實驗中所涉及的化學試劑均為色譜純或分析純級別。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取齒瓣石豆蘭全草10 kg，將其粉碎后過40目篩，用10倍量70%乙醇依照浸漬的方法依次提取3次(每次浸4 h)，然后合并3次乙醇提取液，減壓蒸發濃縮后得到濃縮提取物2.6 kg。取提取物1.0 kg，再將10倍的95%乙醇加熱回流提取3次(每次4 h)。乙醇提取液減壓蒸發濃縮后，得到的棕色浸膏用水再次分散攪拌，用氯仿、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取液減壓濃縮回收溶劑后得浸膏，得到浸膏460 g棕色物，水溶解后用Diaion HP-20型大孔吸附樹脂吸附，分別用水、15%乙醇溶液、45%乙醇溶液及75%乙醇溶液洗脫進行層析分離經TLC檢測合并相同流分，得到4個部分(Fr.1～4)。Fr.1(5.8 g)經反相硅膠色譜柱，氯仿-甲醇(20∶1～5∶1)系統梯度洗脫，目標成分再經結晶得到化合物1(21 mg)、化合物2(9 mg)。Fr.2(6.4 g)再經反相硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(20∶1～10∶1)混合溶劑梯度洗脫得到化合物3(11 mg)、化合物4(6 mg)和化合物5(15 mg)。Fr.3(7.6 g)經LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(5∶1～1∶10)混合溶劑甲醇洗脫，反復重結晶后得到化合物6(13 mg)和化合物7(9 mg)。Fr.4(4.5 g)經反相硅膠柱色譜，氯仿-丙酮(20∶1～5∶1)系統梯度洗脫，收集到了化合物8(16 mg)、化合物9(5 mg)。

2.2 結構鑒定

確認化合物結構主要是根據化合物特有的物理和化學性質以及化合物的波譜數據。化合物的物理和化學性質包含化合物的形狀、熔點及化學特征反應等。化合物的波譜數據主要包括紅外光譜(IR)數據、紫外光譜(UV)數據、核磁共振碳譜和氫譜(13C-NMR和1H-NMR)數據、電子轟擊離子源-質譜聯用(EI-MS)數據。從齒瓣石豆蘭中乙醇提取物分離得到的化合物依據實驗測試結果，鑒定其結構如下。

化合物1：淡黃色針狀結晶，分子式為C15H10O4，mp：317～318 ℃。化合物通過鹽酸-鎂粉的試驗，試驗結果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。紅外光譜(IR)(KBr)提示：羥基的最大吸收在3 265 cm-1處，C=O的吸收峰：1 709 cm-1處。1 627、1 586、1 511、1 456、1 289、1 249、1 209、856 cm-1幾處峰提示為此結構為苯環。UV(乙醇)nm：219，295。EI-MS：m/z 254.7[M]+。1H-NMR(CD3OD，400 MHz)δ：6.75(d，2H，J=8.2 Hz，H-6，8)，6.89(d，2H，J=2.0 Hz，H-3’，-5’)，7.41(d，2H，H-2’，-6’)，7.9(d，1H，H-5)，8.21(s，1H，H-1)，9.7(s，1H，OH)，10.81(s，1H，OH)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ：102.1(C-3’，5’)，116.1(C-6，8)，122.4(C-4)，123.5(C-2)，125.7(C-1’)，128.2(C-2’，6’)，131.1(C-5)，153.2(C-1)，156.9(C-7，4’)，175.3(C-3，C=O)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[5]報道基本一致，故鑒定為7-羥基-3-(4’-羥苯基)異黃酮。

化合物2：淡黃色針狀，分子式為C15H10O7，mp：311～313 ℃。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 442cm-1處有羥基的最大吸收峰。C=O的吸收峰在1 612 cm-1和1 660 cm-1處。苯環吸收：1 625、1 581、1 511、1 428、1 145、1 119、1 011、821cm-1。EI-MS：m/z 302[M]+。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ：6.01(d，1H，J=2.3Hz，H-6)，6.21(d，1H，J=2.4Hz，H-8)，6.61(d，1H，J=8 Hz，H-5’)，6.75(d，1H，J=8.5 Hz，H-6’)，6.61(d，1H，J=8 Hz，H-5’)，7.13(d，1H，J=8，2.5 Hz，H--2’)，9.23(s，1H，3’-OH)，9.33(s，1H，4’-OH)，9.23(d，1H，4’-OH)，10.21(s，1H，7-OH)，12.23(s，1H，5-OH)，13.02(s，1H，3-OH).13C-NMR(CD3OD，100MHz)δ：95.5(C-8)，98.3(C-6)，104.9(C-4)，112.8(C-6’)，118.1(C-3’)，120.8(C-2’)，125.8(C-1’)，138.2(C-2)，146.9(C-4’)，147.9(C-5’)，160.5(C-1)，164.2(C-5)，166.2(C-7)，179.1(C-3，C=O)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[6]報道基本一致，故鑒定為槲皮素。

化合物3：白色粉末狀，分子式為C8H8O3，mp：81～82 ℃。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示：在3 268 cm-1有羥基的吸收峰。1 627、1 589、1 514、1 458 cm-1顯示為苯環。1H-NMR(DMSO，300 MHz)譜芳香區中δ7.11(1H，d，J=1.9 Hz)，7.32(1H，d，J=8.0 Hz)和7.38(1H，d，J=2.0Hz)為一典型的1，2，4三取代苯環的特征吸收。13C-NMR(DMSO，400MHz)中所顯示的δ55.4說明該分子中有-OCH3的存在。1H-NMR(DMSO，300 MHz)δ:9.79(1H，s，CHO)，7.41(1H，d，J=2.0 Hz)，7.34(1H，d，J=2.3 Hz)，7.01(1H，d，J=2.3 Hz)，3.87(3H，s，-OCH3)，4.95(1H，s，OH)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：189.9(-CHO)，148.5(C-4)，153.4(C-3)，128.7(C-1)，126.4(C-6)，116.5(C-5)，113.7(C-2)，55.8(-OCH3)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[7]報道基本一致，故鑒定為2-甲氧基-1-羥基苯甲醛，又名香蘭素。

化合物4：淡黃色油狀，分子式為C16H12O4，mp：291～293 ℃。化合物通過鹽酸-鎂粉的試驗，試驗結果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示，在3 601cm-1處有羥基的最大吸收峰。C=O的吸收峰在1 615 cm-1和1 685 cm-1處。苯環吸收：1 597、1 601、1 572、1 467、1 136、1 120、1 108、838 cm-1。MS(ESI)m/z=268.01[M]+。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ：3.81(s，3H，-OCH3)，6.21(s，1H，H-8)，7.11(s，1H，H-5)，7.15(dd，1H，J=2.2Hz，H-4’)，7.22(d，2H，J=8.0Hz，H-3’，5’)，7.43(d，2H，J=8.0Hz，H-2’，6’)，8.03(s，1H)，8.36(s，1H，7-OH)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：56.3(6-OCH3)，107.2(C-8)，117.3(C-5)，118.6(C-10)，122.8(C-3)，126.9(C-2’，6’)，128.4(C-4’)，130.8(C-3’，5’)，123.2(C-3)，131.9(C-1’)，152.1(C-9)，157.5(C-7)，158.2(C-2)，180.8(C-4，C=O)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[8]報道基本一致，故鑒定為6-甲氧基-7羥基-異黃酮。

化合物5：無色針狀粉末，分子式為C7H6O3，mp：158～159 ℃。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 642cm-1處有羥基的最大吸收峰。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ11.19(s，1H，-COOH)顯示有活潑氫。1H-NMR(CD3OD，400 MHz)譜芳香區中信號中在低場區有4組芳香氫質子信號：δ7.79(dd，1H，J=8.0Hz，H-6)，7.51(d，1H，J=7.9，7.5Hz，H-4)，7.01(d，1H，J=8.0Hz，H-3)，6.89(d，1H，J=7.9，7.2Hz，H-5)提示分子中存在苯環的1,2-二取代。EI-MS：m/z 137.1[M]+。13C-NMR(CD3OD，100MHz)δ：113.5(C-1)，118.2(C-3)，132.1(C-6)，135.9(C-4)，162.5(C-2)，173.1(-COOH)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[9]報道基本一致，故鑒定為鄰羥基苯甲酸，又名水楊酸。

化合物6：淡黃色針狀，分子式為C17H14O5，mp：138～139 ℃。化合物通過鹽酸-鎂粉的試驗，試驗結果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 510cm-1處有羥基的最大吸收，在1 728 cm-1有羰基吸收峰。苯環吸收：1 637、1 598、1 511、1 453 cm-1。EI-MS：m/z 299.1[M+H]+。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ：3.75(s，3H，-OCH3)，3.8(s，3H，-OCH3)，6.76(d，2H，H-3’，-5’)，6.81(d，1H，H-8)，6.84(d，1H，H-7)，7.22(d，2H，H-2’，-6’)，7.25(s，1H，H-5)，14.1(s，1H，-OH)。在較高場中出現的強單峰結合化學位移和碳譜13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)中所顯示的δ55.8兩峰，說明該分子中有兩個-OCH3，其質子信為δ3.80(s，6H)。13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)δ：55.8(2-OCH3)，116.3(C-3’，5’)，117.3(C-5)，118.9(C-8)，128.4(C-2’，6’)，121.7(C-7)，125.6(C-4)，137.3(C-2)，150.1(C-9)，155.4(C-6)，159.4(C-4’)，161.1(C-1)，179.5(C-3，C=O)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[10-11]報道基本一致，故鑒定為6-甲氧基-2-(4’-甲氧基苯基)-3-羥黃酮。

化合物7：白色蠟狀固體，分子式為C18H36O2，mp：23～24 ℃，薄層色譜法顯示：在碘蒸氣下有一單紅色斑點，固體化合物可溶于石油醚、乙酸乙酯中。MS(ESI)m/z=284[M]+。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ：1.04(3H，t，J=8.0 Hz，-CH3)，1.28(3H，t，J=8.0 Hz，-CH3)，1.31(24H，t，J=7.8 Hz，-CH2)，2.34(2H，t，J=8.3 Hz，-CH2COO)，4.28(2H，t，J=8.0 Hz，-COOCH2)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：179.5(C=O)，64.31(C-2’，CH2)，34.21(C-2，CH2)，26.54～30.04，26.54，29.15，29.87(C-3-15，CH2)，15.21(C-16，-CH3)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定為棕櫚酸乙酯。

化合物8：淡黃色針狀，分子式為C16H12O4，mp：280～282 ℃。化合物通過鹽酸-鎂粉的試驗，試驗結果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示，在3 615 cm-1處有羥基最大吸收。C=O的吸收峰在1 619 cm-1和1 688 cm-1處。苯環吸收：1 592、1 602、1 578、1 460、1 123、1 118、1 103、821 cm-1(苯環C=C伸縮振動)；MS(ESI)m/z=268.03[M]+。1H-NMR(DMSO，300 MHz)譜中芳香區有4個氫信號顯示為δ：6.75(d，2H，J=2.0 Hz，H-3’，5’)、7.21(d，2H，J=2.0 Hz，H-2’，6’)，是典型的AA’BB’系統，說明該結構為對位取代的苯環，對應的碳信號在13C-NMR(DMSO，400MHz)譜中顯示為δ：115.6(C-3’，5’)、127.7(C-2’，6’)。1H-NMR(DMSO，300 MHz)δ：3.86(s，3H，-OCH3)，6.75(d，2H，J=2.0Hz，H-3’，5’)，6.90(d，1H，J=8.0Hz，H-8)，7.13(dd，1H，J=2.3 Hz，H-6)，7.21(d，2H，J=2.0 Hz，H-2’，6’)，7.43(d，1H，J=8.0 Hz，H-7)，7.79(d，1H，J=8.0 Hz，H-5)，8.56(s，1H，4’-OH)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：58.3(3-OCH3)，115.6(C-3’，5’)，119.5(C-8)，122.8(C-6)，123.8(C-1’)，125.1(C-10)，127.7(C-2’，6’)，131.4(C-5)，140.2(C-7)，141.9(C-3)，156.7(C-2)，157.5(C-9)，158.4(C-4’)，179.2(C-4，C=O)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定為3-甲氧基-4’-羥黃酮。

化合物9：黃色針狀結晶，分子式為C17H14O4，mp：228～230 ℃。化合物通過鹽酸-鎂粉的試驗，試驗結果為陽性，提示此化合物為黃酮類成分。薄層色譜法：用5%FeCl3溶液為顯色劑，試驗結果顯示藍黑色，提示此化合物含有酚羥基。IR(KBr)光譜顯示在3 158 cm-1處有羥基的最大吸收峰，1 725 cm-1有羰基吸收峰。在較高場中出現了強單峰，通過化學位移和碳譜13C-NMR(DMSO，400MHz)數據顯示的δ58.6說明該結構中存在-OCH3，其質子的信號為：3.80(s，3H，-OCH3)。苯環吸收：1 701、1 619、1 543、1 427、1 301、1 257、1 229、849 cm-1。UV(乙醇)nm：219，295。MS(ESI)m/z：283.07[M+1]。1H-NMR(DMSO，300 MHz)譜中芳香區有4個氫信號顯示為δ：6.81(d，2H，J=2.2 Hz，H-3’，-5’)、7.25(d，2H，J=8.2 Hz，H-2’，-6’)，是典型的AA’BB’系統，說明該結構為對位取代的苯環，其對應的碳信號于13C-NMR(DMSO，400MHz)譜中顯示為δ：128.3(C-2’，6’)、115.7(C-3’，5’)。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ：2.31(s，3H，H-2)，3.80(s，3H，H-4’)，6.05(s，1H，OH)，6.85(s，1H，H-8)，6.81(d，2H，J=2.2 Hz，H-3’，-5’)，6.97(d，1H，J=8.0 Hz，H-6)，7.25(d，2H，J=8.2 Hz，H-2’，-6’)，7.81(d，1H，J=7.8 Hz，H-5)。13C-NMR(DMSO，400 MHz)δ：20.1(C-CH3)，58.6(4’-OCH3)，107.2(C-8)，110.1(C-6)，113.5(C-3)，115.7(C-3’，5’)，118.2(C-10)，125.1(C-1’)，128.3(C-2’，6’)，131.9(C-5)，155.3(C-2)，158.2(C-9)，159.8(C-4’)，168.3(C-7)，179.5(C-4，C=O)。以上化合物的物理和化學性質以及光譜數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定為4’-甲氧基-2-甲基-7-羥異黃酮。

2.3 齒瓣石豆蘭乙醇提物對人慢性白血病K562細胞、人結腸癌HT-29細胞和人乳腺癌MCF-7細胞株的抑瘤活性的影響

由表1可見，齒瓣石豆蘭醇提物給藥后小鼠體重正常，與陰性對照組比較無統計學差異(P=0.75，0.36，0.39，均>0.05)，給DDP(1 mg·kg-1)后小鼠體重明顯減輕，為(17.73±1.63)g，與陰性對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。各實驗組分別給予齒瓣石豆蘭醇提物10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1三種濃度后，瘤重分別為(1.55±0.680)、(1.97±0.34)、(0.17±0.38)g，與陰性對照組比較差異具有統計學意義(P=0.018，0.002，0.001，均<0.01)。K562、HT-29、MCF-7三種腫瘤細胞生長明顯受到抑制，且呈現出較好的劑量依賴性。

組別體重給藥前給藥后瘤重抑制率(%)K562HT-29MCF-7 陰性對照組20.16±2.3525.63±3.741.84±0.93/// 陽性對照組22.03±2.2117.73±1.63??0.64±0.2167.9568.6564.39乙醇提取物10mg·kg-121.67±2.2427.84±3.131.55±0.68?23.3426.9121.05 20mg·kg-121.75±2.3729.17±4.841.97±0.34??45.8247.2540.92 40mg·kg-121.69±2.3829.65±4.160.17±0.38??50.9752.4549.42??

注：與陰性對照組比較，**P<0.01；與陰性對照組比較，*P<0.05。

2.4 抗腫瘤活性研究

采用MTT法[16]，以化合物1～9(4個不同濃度)為供試藥物對K562、MCF-7進行體外抗腫瘤試驗，結果見表2。表2顯示：化合物7抗腫瘤活性較弱，化合物2、3、5幾乎沒有抑制K562、MCF-7細胞生長的作用，對K562、MCF-7的抑制率較低。化合物5、7在低濃度下甚至可刺激兩種細胞的生長。化合物1、4、6、8、9能明顯抑制K562、MCF-7細胞的生長，抗腫瘤活性較好，且同一化合物在相同濃度下對MCF-7抑制作用更好，可能是由于黃酮類化合物可明顯抑制K562、MCF-7生長，作用機制有待進一步研究。

表2 化合物1-9對K562、MCF-7細胞的抑制作用

3 討論

齒瓣石豆蘭全草具有較高的藥用價值，具有養胃生津、祛風除濕、消腫止痛、清熱化痰、舒筋骨、涼血活血的功效。本研究對齒瓣石豆蘭的乙醇提取部分進行了分離及鑒定，將乙醇提取物經硅膠柱層析、薄層層析、LH-20型葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜分離和重結晶等方法進行分離純化后得到9個單體化合物，并根據化合物的特有物理和化學性質以及化合物的波譜數據，鑒定其結構分別為化合物1：7-羥基-3-(4’-羥苯基)異黃酮；化合物2：槲皮素；化合物3：2-甲氧基-1-羥基苯甲醛；化合物4：6-甲氧基-7羥基-異黃酮；化合物5：鄰羥基苯甲酸；化合物6：6-甲氧基-2-(4’-甲氧基苯基)-3-羥黃酮；化合物7：棕櫚酸乙酯；化合物8：3-甲氧基-4’-羥黃酮；化合物9：4’-甲氧基-2-甲基-7-羥異黃酮。所有化合物均為首次從齒瓣石豆蘭全草中分離得到。其中化合物1、8、9為首次報道。采用MTT方法篩選具有明顯抗腫瘤活性的化合物，結果顯示化合物1、4、6、8、9具有較好的抗腫瘤活性，對K562、HT-29、MCF-7三種腫瘤細胞生長有明顯的抑制作用，并呈現出較好的劑量依賴性。

本研究結果豐富了傳統中藥齒瓣石豆蘭的活性成分以及抗腫瘤活性研究，并對黃酮類化合物抗腫瘤的作用機制研究具有一定的參考價值，為今后齒瓣石豆蘭化學成分的藥理活性研究提供了理論依據。