檳榔等四種興奮劑不同服用量的興奮作用比較研究

陳光宇，瞿昊宇，何 群，羅麗華，謝夢(mèng)洲*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)診斷研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南 益陽 413000)

檳榔為棕櫚科植物檳榔(ArecaCatechuL.)的干燥成熟種子，含生物堿0.3%～0.6%，以檳榔堿為主(0.1%～0.5%)。長(zhǎng)期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，檳榔具有健胃消食、行氣利水、殺蟲瀉下、利濕除疸等功效。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)檳榔具有較好的興奮作用[1-4]，特別是譽(yù)滿天下的口味王和成天下檳榔及口味王精制青果食用檳榔，久負(fù)盛名，備受消費(fèi)者青睞，銷量逐年上升。但口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔的興奮作用與經(jīng)典、公認(rèn)、興奮作用最好的即溶咖啡飲料和紅牛維生素功能飲料究竟有何區(qū)別，口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔興奮作用的最佳服用量是多少，口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔興奮作用的特色是什么，這些皆不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，檳榔興奮作用不隨服用量的增加而增加，而是存在一個(gè)興奮作用最佳的服用量；但即溶咖啡飲料和紅牛維生素功能飲料在與檳榔同等劑量的情況下興奮作用較弱，服用量增加興奮作用加大，故本實(shí)驗(yàn)通過觀察四種產(chǎn)品不同服用量單次服用的興奮作用(小鼠自主活動(dòng)次數(shù))經(jīng)時(shí)變化規(guī)律，建立數(shù)學(xué)模型，提取興奮作用速度參數(shù)及強(qiáng)度參數(shù)，采用95%可信區(qū)間重疊法比較四種產(chǎn)品不同服用量興奮作用的特性和差別，為廣大消費(fèi)者進(jìn)一步深入了解、科學(xué)正確地服用口味王和成天下檳榔及口味王精制青果食用檳榔提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試樣品資料

口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔、即溶咖啡飲料、紅牛維生素功能飲料皆由湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司提供；蒸餾水由本部門自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠50只，雄雌各半，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：43004700038539；實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK(湘)2013-0005。小鼠在SPF級(jí)動(dòng)物室喂養(yǎng)，空調(diào)恒溫(25±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，照明時(shí)間隨同自然變化；全價(jià)顆粒飼料從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專用飼料廠家購(gòu)進(jìn)。

1.3 儀器設(shè)備

YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站產(chǎn)品)；YAZD-3/5/10/10不銹鋼電熱蒸餾水器(溫州標(biāo)諾儀器有限公司)；KM-250 DE中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；YP-B50001電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；RHP-400型高速多功能粉碎機(jī)(浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

健康成年SPF級(jí)ICR小鼠，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：43004700038539；實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK(湘)2013-0005。50只，雄雌各半，隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為口味王和成天下檳榔組、口味王精制青果食用檳榔組、咖啡飲料陽性對(duì)照組、紅牛維生素功能飲料陽性對(duì)照組、蒸餾水空白對(duì)照組。

2.2 給藥劑量

口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔皆制成提取濃縮液，即溶咖啡飲料制成液體，紅牛維生素功能飲料使用原液。灌胃量的低服用量為0.1 mL/10 g，高服用量為0.15 mL/10 g；給予樣品液體積，低服用量為10 mL/kg，高服用量為15 mL/kg；純化水灌胃按低服用量10 mL/kg，高服用量15 mL/kg。

2.3 四種樣品灌胃液體的制備方法

2.3.1 制備口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔濃縮液 各取20只小鼠單次灌胃用量的口味王和成天下檳榔及口味王精制青果食用檳榔產(chǎn)品，分別粉碎成絲狀粗粉，分別超聲提取2次，第一次超聲提取加50倍量蒸餾水超聲提取60 min，過濾；濾渣第二次超聲提取加40倍量蒸餾水超聲提取40 min，過濾，濾渣棄去，合并2次提取液，濾液50 ℃分別濃縮成灌胃用濃度。

2.3.2 制備即溶咖啡飲料 取20只小鼠單次灌胃用量的即溶咖啡飲品15 g，加278 mL 95 ℃蒸餾水，保溫下不斷攪拌30 min，冷卻至室溫，調(diào)成灌胃用濃度。

2.3.3 制備紅牛維生素功能飲料 取20只小鼠灌胃用量的紅牛維生素功能飲料原液。

2.4 觀察指標(biāo)

小鼠灌胃(低服用量：0.1 mL/10 g，高服用量：0.15 mL/10 g)給予各樣品液后，于5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min，每隔5 min測(cè)定小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)，記錄每次測(cè)定結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)每段平均值為縱坐標(biāo)繪圖，見圖1、圖2。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)累積平均值為縱坐標(biāo)繪圖，累積計(jì)算結(jié)果，見圖3、圖4。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 測(cè)定結(jié)果

見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 檳榔等樣品低服用量興奮作用每次測(cè)定結(jié)果曲線

圖2 檳榔等樣品高服用量興奮作用每次測(cè)定結(jié)果曲線

圖3 檳榔等樣品低服用量興奮作用累積計(jì)算結(jié)果曲線

圖4 檳榔等樣品高服用量興奮作用累積計(jì)算結(jié)果曲線

3.2 結(jié)果分析

①由圖1、圖2的曲線圖可知，口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔、即溶咖啡飲品、紅牛維生素功能飲料興奮作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蒸餾水的興奮作用(類似于給藥前小鼠自主活動(dòng)次數(shù))。

②口味王和成天下檳榔、口味王精制青果食用檳榔、即溶咖啡飲品、紅牛維生素功能飲料四組樣品低、高服用量單次服用興奮作用隨時(shí)間的變化規(guī)律為非連續(xù)型函數(shù)，因此無法建立數(shù)學(xué)模型，總的趨勢(shì)是服用后興奮作用迅速達(dá)到最大值，然后興奮作用趨于恒定，曲線呈波動(dòng)狀態(tài)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)興奮作用緩緩下降。四組樣品的低、高服用量興奮作用的快慢(小鼠自主活動(dòng)次數(shù)達(dá)到最大值所需時(shí)間Tmax)及強(qiáng)度(小鼠自主活動(dòng)次數(shù)最大值Ymax)估算數(shù)據(jù)，采用95%可信區(qū)間重疊法求出誤差區(qū)間，見表1。

表1 各組樣品低、高服用量興奮作用快慢及強(qiáng)度估算

由表1結(jié)果可知，95%可信區(qū)間重疊，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，由此可知，低服用量興奮作用由快到慢依次為：口味王精制青果檳榔、紅牛維生素功能飲料、口味王和成天下檳榔、即溶咖啡飲品；低服用量興奮作用由強(qiáng)到弱依次為：口味王精制青果檳榔和即溶咖啡飲品、口味王和成天下檳榔、紅牛維生素功能飲料；口味王精制青果檳榔、即溶咖啡飲品興奮作用均較強(qiáng)(Ymax為146次、145次，95%可信區(qū)間重疊，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，依次為)，但口味王精制青果檳榔興奮作用起效時(shí)間為10 min，即溶咖啡飲品起效時(shí)間為35 min，紅牛維生素功能飲料興奮作用起效雖快，但興奮作用較弱(Ymax為118次)。

高服用量興奮作用由快到慢依次為：口味王和成天下檳榔、即溶咖啡飲品、紅牛維生素功能飲料、口味王精制青果檳榔；高服用量興奮作用由強(qiáng)到弱依次為：口味王精制青果檳榔、紅牛維生素功能飲料和即溶咖啡飲品、口味王和成天下檳榔。

口味王和成天下檳榔低、高服用量興奮作用強(qiáng)弱相當(dāng)，但高服用量興奮作用提早了10 min；口味王精制青果檳榔低、高服用量興奮作用強(qiáng)弱相當(dāng)，但興奮作用起效略推遲5 min；即溶咖啡飲品低、高服用量興奮作用強(qiáng)弱相當(dāng)，但高服用量興奮作用提早了25 min；紅牛維生素功能飲料低、高服用量興奮作用皆在10 min達(dá)峰值，但高服用量興奮作用強(qiáng)度遠(yuǎn)大于低服用量，是低服用量的1.2倍。

口味王精制青果檳榔低、高服用量興奮作用強(qiáng)弱皆居首位，口味王和成天下檳榔和紅牛維生素功能飲料低、高服用量興奮作用強(qiáng)弱顛倒，即溶咖啡飲品興奮作用時(shí)間和強(qiáng)弱的排序差別很大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一樣品興奮作用快慢和強(qiáng)弱與服用量不成正比；不同樣品興奮作用快慢和強(qiáng)弱的差異與服用量有關(guān)。

3.3 累積計(jì)算數(shù)據(jù)處理結(jié)果

(1)為獲得檳榔等五組樣品低、高服用量興奮作用速度參數(shù)，采用小鼠自主活動(dòng)次數(shù)累積值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪圖(見圖3、圖4)，由圖3、圖4可知，小鼠自主活動(dòng)次數(shù)累積值隨時(shí)間變化的規(guī)律為連續(xù)型變量，可建立兩變量間的數(shù)學(xué)表達(dá)式，即數(shù)學(xué)方程式(或數(shù)學(xué)模型)，故采用DPSv7.05版建立數(shù)學(xué)模型，通過模型參數(shù)(R2、F、P)的判斷找出最接近的數(shù)學(xué)模型(數(shù)學(xué)表達(dá)式或數(shù)學(xué)方程式)，數(shù)學(xué)方程線性化后自變量的系數(shù)(即方程中的斜率)即為五組樣品低、高服用量興奮作用速度參數(shù)K，將低、高服用量后2 min的指標(biāo)數(shù)值代入各自對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)模型中，計(jì)算各自小鼠自主活動(dòng)次數(shù)Y2 min，采用兩變量間的剩余誤差(也稱為模型誤差)計(jì)算95%置信區(qū)間(誤差區(qū)間)，即可知各組低、高服用量2 min時(shí)興奮作用(小鼠自主活動(dòng)次數(shù))Y2 min的差別，見表2。

表2 不同服用量興奮作用累計(jì)值建模及數(shù)據(jù)處理結(jié)果

續(xù)表2 不同服用量興奮作用累計(jì)值建模及數(shù)據(jù)處理結(jié)果

注：R2是決定系數(shù)，反映兩變量之間的相關(guān)程度，愈接近1，相關(guān)性愈好；F代表方差，反映數(shù)學(xué)模型的擬合偏差，數(shù)值愈大，表明數(shù)學(xué)模型的擬合偏差愈小，準(zhǔn)確度愈高；P代表顯著性水平，愈小愈顯著，一般P值應(yīng)<0.05。

(2)由表2結(jié)果可知，檳榔等五組樣品低服用量興奮作用動(dòng)態(tài)變化規(guī)律(數(shù)學(xué)模型)皆滿足冪函數(shù)模型(冪函數(shù)模型系生物體運(yùn)動(dòng)規(guī)律的常見數(shù)學(xué)模型)，反映檳榔等四組樣品短期服用后的興奮規(guī)律與服用蒸餾水的興奮規(guī)律相同，但興奮作用起效快，興奮作用程度增強(qiáng)；而高服用量興奮作用動(dòng)態(tài)變化規(guī)律皆滿足Michaelis Menten模型，即服用量持續(xù)增加或減少時(shí)，興奮作用程度趨向于一種穩(wěn)態(tài)，說明服用量不同興奮作用動(dòng)態(tài)變化規(guī)律亦不同。

(3)從表2中數(shù)學(xué)方程的斜率數(shù)據(jù)(K)可知，低服用量興奮作用速度由快到慢依次為：口味王精制青果檳榔≈口味王和成天下檳榔≈紅牛維生素功能飲料>即溶咖啡飲品>蒸餾水；而高服用量興奮作用速度由快到慢依次為：即溶咖啡飲品≈口味王精制青果檳榔>口味王和成天下檳榔>紅牛維生素功能飲料≈蒸餾水。

(4)從表2中2 min各組的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)可知，低服用量興奮作用最強(qiáng)的是口味王精制青果檳榔(Y2 min=61次)，其次是口味王和成天下檳榔(Y2 min=59次)，再次是紅牛維生素功能飲料(Y2 min=57次)，最后是即溶咖啡飲品(Y2 min=46次)，四組樣品興奮作用強(qiáng)度皆大于蒸餾水(Y2 min=39次)；高服用量興奮作用依次為：口味王精制青果檳榔≈紅牛維生素功能飲料≈即溶咖啡飲品≈口味王和成天下檳榔>蒸餾水。

(5)口味王和成天下檳榔低服用量興奮作用優(yōu)于高服用量；即溶咖啡飲品高服用量興奮作用優(yōu)于低服用量；口味王精制青果檳榔、紅牛維生素功能飲料、蒸餾水皆與低、高服用量興奮作用相同。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幾種具有興奮作用的食品，服用量不同興奮作用的差別不同；同種食品服用量不同，興奮作用的差別亦不同，所以應(yīng)在同一服用量前提下比較幾種食品興奮作用的差別，才有意義和可比性。

每段測(cè)定結(jié)果平均值是每5 min這段時(shí)間內(nèi)的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，反映了小鼠興奮作用的快慢和強(qiáng)弱；累積計(jì)算結(jié)果是從時(shí)間起點(diǎn)0到某時(shí)間(如20 min)內(nèi)的小鼠自主活動(dòng)總次數(shù)，可以找出動(dòng)態(tài)變化規(guī)律(即數(shù)學(xué)表達(dá)式)來計(jì)算小鼠興奮作用快慢和強(qiáng)弱的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

興奮作用建立數(shù)學(xué)模型的意義：興奮作用原設(shè)計(jì)方案為2 min測(cè)定1次小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)際操作起來不可行，而且測(cè)定誤差太大，故調(diào)整為每5 min測(cè)定1次小鼠自主活動(dòng)次數(shù)為佳，但要了解2 min的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)就必須建立興奮作用的數(shù)學(xué)模型，將2 min的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)代入數(shù)學(xué)方程式中計(jì)算出來，與此同時(shí)可以采用剩余誤差法計(jì)算95%可信區(qū)間。

給藥途徑的說明：由于人服用檳榔一般是咀嚼，藥汁吸收途徑是通過口腔黏膜，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)只能灌胃，藥汁吸收途徑是胃腸道，在吸收時(shí)間和吸收量方面可能會(huì)產(chǎn)生差異，所以2 min的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)是否與人2 min的興奮作用等同，有待進(jìn)一步論證，但五種樣品比較皆采用灌胃途徑，對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。

由于小鼠自主活動(dòng)次數(shù)組內(nèi)變異很大，故本實(shí)驗(yàn)將小鼠自主活動(dòng)次數(shù)取平均值來建立數(shù)學(xué)方程，再采用剩余誤差(模型誤差)求95%可信區(qū)間，用95%可信區(qū)間重疊法求誤差，因剩余誤差很小，所以處理結(jié)果誤差小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析采用95%可信區(qū)間重疊法進(jìn)行比較，比完全隨機(jī)t檢驗(yàn)法更加直觀、清晰、一目了然，特別適合用于多組樣本相互之間的比較和分析，值得推廣應(yīng)用。