聚類分析結合主成分分析評價不同產地枳殼藥材的一致性與差異性

張智敏，聶 莼，李亞梅，彭買姣，彭江麗，林麗美*，羅 堃*

(1.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙410208；2.湖南中醫藥大學 湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室/湖南省中藥不良成分快速檢測及脫除工程技術研究中心，湖南 長沙410208)

枳殼(FructusAurantii)始載于《雷公炮炙論》，宋代《開寶本草》首次將枳殼從枳實條目下分離出來，獨立作為一種藥物記載。2015年版的《中國藥典》記載了其來源，為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實[1]，主要分布于我國長江流域及南方各省區。傳統中醫中枳殼主要用于治療胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內停、臟器下垂[2]。《中藥炮制學》認為枳殼生品較峻烈，長于破氣化痰，麩炒可以緩和其烈性，從而達到消積化痞的目的[3]。研究表明，枳殼的化學成分主要由黃酮類化合物、揮發油、香豆素類及少量的生物堿類組成[4,5]，具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗高血壓[8]和抗休克[9]等活性。黃酮苷類是枳殼藥理作用研究的主要物質基礎，主要為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和橙皮素等[10]，被證實有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抑制毛細血管脆性等多種功效[11-14]。

目前中國藥典以柚皮苷和新橙皮苷含量作為其質量控制指標，2015年版中國藥典規定枳殼含柚皮苷(C27H32O14)不得少于4.0%，新橙皮苷(C28H34O15)不得少于3.0%。據文獻[15]報道，不同產地的枳殼藥材的柚皮苷和新橙皮苷含量存在差異，其中傳統產區如江西、四川、湖南等地的枳殼藥材質量相對較佳。

本研究通過HPLC指紋圖譜結合聚類分析、主成分分析對不同產地枳殼質量進行較為系統的評價，以期為枳殼質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(包含E2695四元梯度泵，2489UV檢測器，Empower3軟件)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版(國家藥典委員會)；SB25-12DT型超聲波清洗儀(新芝公司)；CP114分析天平(美國奧豪斯)。

1.2 材料

蕓香柚皮苷對照品(批號MUST-16030408)，購于成都曼斯特生物科技有限公司；柚皮苷對照品(批號10552-201301)、橙皮苷對照品(批號10089-201203)、新橙皮苷對照品(批號10477-201203)，購于南昌貝塔生物科技有限公司；橙皮素對照品(批號B20184)、川陳皮素對照品(批號B20199)，購于上海源葉生物科技有限公司。

水為超純水，乙腈和甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

枳殼藥材經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，詳細信息見表1。

表1 枳殼樣本信息

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液制備

分別精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素對照品適量，置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為0.022 7 mg/mL、0.005 9 mg/mL、0.016 7 mg/mL、0.008 0 mg/mL、0.000 8 mg/mL、0.000 6 mg/mL的混合對照品溶液，避光保存。

2.2 供試品溶液制備

取枳殼樣本打粉過篩，精密稱定0.2 g，置于具塞離心管中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，取濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～6 min，20%～23%乙腈；6～13 min，23%～35%乙腈；13～16 min，35%～55%乙腈；16～26 min，55%～70%乙腈；流速1.0 mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的峰面積的RSD分別為1.23%、0.32%、0.13%、0.18%、0.48%、0.38%(n=6)，表明儀器精密度良好。混合對照品的HPLC色譜見圖1。

圖1 混合對照品HPLC色譜

2.4.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液(S33)，分別于制備后0、4、8、12、24 h后進樣10 μL，測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的峰面積的RSD分別為0.72%、0.58%、1.12%、0.53%、0.70%、0.65%。表明供試品溶液在24 h內性質穩定。

2.4.3 重復性試驗 取樣品(S33)適量，平行制備6份供試品溶液并依法測定。結果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的峰面積的RSD值分別為1.19%、1.17%、1.19%、1.39%、0.95%、1.26%(n=6)。表明本試驗重復性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的樣品(S33)6份，每份0.1 g，分別加入一定量的對照品，按照供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，進行回收率測定。結果表明，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的加樣回收率的RSD值分別為1.32%、1.89%、1.50%、1.77%、2.41%、2.28%。表明該方法的準確度良好。

2.4.5 枳殼中6種黃酮類成分含量測定 以混合對照品中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的濃度和HPLC峰面積為標準，分別計算37批次不同產地枳殼藥材中該6種黃酮類成分所占的百分含量。結果見表2。

表2 枳殼中六種黃酮類成分的百分含量 (%)

從表2可以看出，不同產地的枳殼藥材，其化學成分存在差異，甚至同一地區的枳殼藥材質量也并不統一，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素含量均不高的枳殼樣本有S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S18、S20、S21、S26、S27。

此外，通過對比S1和S8、S2和S7、S3和S6、S30和S34、S31和S35、S32和S36可以發現，枳殼生品經麩炒炮制后，黃酮類成分含量有所下降，與文獻[16-17]報道的枳殼麩炒前后色譜行為一致，但成分含量普遍減少的結論相符合。S30～S33反映的是同一種植地的枳殼藥材于不同采收期的樣本。從表2可以看出，4個不同采摘期的枳殼藥材中柚皮苷和新橙皮苷的含量均符合藥典標準，其中7月5日采摘的枳殼生品(S31)的黃酮類成分含量最高，隨著采收時間的推后，其含量呈現下降趨勢。該結論與李正紅等[18]研究結果一致。據報道，枳殼從7月初至8月初均可采集，隨著枳殼成熟度的增加，總黃酮含量呈現下降趨勢，但柚皮苷和新橙皮苷含量則呈上升趨勢[19]。隨著枳殼成熟度的進一步增加，果瓤迅速增大，果皮變薄，柚皮苷和新橙皮苷含量下降[20]。因此，枳殼于大暑前后采摘整體品質最佳。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 枳殼指紋圖譜的建立 按照“2.2”項下方法制備37批次枳殼藥材供試品，按照“2.3”項下方法測定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統以37批枳殼色譜圖為基礎建立標準指紋圖譜(見圖2)，確定19個共有峰，生成對照圖譜(見圖3)，與對照品溶液比對，鑒定3號峰為蕓香柚皮苷、4號峰為柚皮苷、5號峰為橙皮苷、7號峰為新橙皮苷、15號峰為橙皮素、19號峰為川陳皮素。

圖2 37批次枳殼藥材指紋圖譜

2.5.2 枳殼藥材相似度評價 以中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件生成的枳殼對照指紋圖譜為標準，計算相似度(結果見表3)。結果表明，37批枳殼藥材中，除了S1、S5、S8和S18，其余樣本的相似度均大于0.90。

表3 相似度評價結果

2.5.3 主成分分析 主成分分析也稱主分量分析，是利用降維的思想，將多個變量(指標)化為少數幾個互不相關的綜合變量(指標)的統計方法。主成分分析在求出主成分后，選擇前P個主成分，構造綜合評價函數可對樣品進行綜合評價。主成分個數的選取按以下原則來確定：①以累積貢獻率來確定，當前P個主成分的累積貢獻率達到某一特定的值時(一般以>70%為宜)，則保留前P個主成分；②以特征值大小來確定，即若主成分的特征值≥1，則保留該主成分[21]。采用SPSS 17.0軟件對37個不同產地枳殼藥材的19個共有峰(變量)峰面積原始數據進行標準化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據，進行主成分分析，解釋的總方差結果見表4，碎石圖見圖5。

表4 解釋的總方差

圖5 碎石圖

結合表4和圖5可知，枳殼藥材的主成分分析中前5個主成分的特征值均大于1，且碎石圖的連線較陡峭，累積方差貢獻率為86.435%，可以反映整體指標86.435%的信息，因此提取前5個主成分進行分析較為合適。

成分載荷矩陣反映各主成分與原始指標之間相互關系的密切程度與作用的方向[21]，載荷的絕對值越大，其對于主成分的影響就越大。本研究的相關系數矩陣結果見表5所示。

表5 成分載荷矩陣

從表5可以看出，第一主成分與原始變量峰10、峰11、峰15、峰6、峰16、峰18之間的關系最為密切(載荷絕對值>0.8)。

以第1、第2、第3主成分為變量得到的三維投影載荷圖(圖6)，在投影圖中距離原點較遠的點，峰1、峰2、峰3(蕓香柚皮苷)、峰5(橙皮苷)、峰7(新橙皮苷)對區分不同產地的枳殼藥材起到較大作用。

圖6 載荷圖

通過計算主成分得分、綜合得分[22]，可對不同產地的枳殼藥材品質進行評價。以前5個主成分貢獻率為權重系數，對不同產地的枳殼藥材進行綜合評價，計算主成分得分及綜合得分，結果見表6。

表6 不同產地枳殼主成分得分、綜合得分及排名

由主成分排名可知，湖南沅江和江西新干產地的枳殼藥材質量最佳。同一種植地而不同采收期的枳殼藥材(S30-S33)中，7月5日采摘的枳殼生品(S31)質量最佳，與黃酮類成分的含測結果一致。

2.5.4 聚類分析 聚類分析是將樣品按照品質特性相似度逐漸聚合在一起，最終按照類別的綜合性質將多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程。本研究應用SIMCA 13.0分析軟件進行層序聚類分析，得到分類聚類樹狀圖(圖7)。

從圖中可知，在類間距為50時，S13、S14、S15、S19、S23、S25、S28、S29聚為一類，這些樣本的黃酮含量均較高，且主成分排名位于前10，該類樣本主要為湖南沅江和江西新干產地的枳殼藥材；六種黃酮含量均不高，且主成分排名末尾的樣本S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S12、S18、S20、S26、S27聚為了一類，該類樣本主要為湖南、江西、四川不明具體產地信息的網購及非種植地銷售枳殼藥材；剩余的樣本S7、S9、S10、S11、S16、S17、S21、S22、S24、S30、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37聚為一類，該類樣本主要為湖南、四川產地的枳殼藥材。聚類分析的結果與主成分分析以及含測結果均吻合，與相似度評價結果大體一致。

圖7 37批次枳殼樣品的HCA樹狀圖

3 討論

本研究通過聚類分析結合主成分分析，以及主要黃酮類成分含量測定分析，發現不同產地的枳殼藥材的化學成分存在差異，且同一地區的枳殼藥材質量也并不統一，說明影響藥材質量的因素不僅為產地，采收時間、加工等環節也影響著藥材的質量。