蒙藥材大托葉云實質量標準研究

牧 丹，蘇日娜，布 仁，白文明，那生桑，趙婷婷

(1.內蒙古醫科大學 藥學院，內蒙古 呼和浩特 010100；2.內蒙古醫科大學 蒙醫藥研究院，內蒙古 呼和浩特 010100)

蒙藥材大托葉云實(CaesalpiniaecristaeSemen)為豆科植物大托葉云實(CaesalpiniacristaL.)的干燥成熟種子，蒙語名卓冷-烏熱、占巴來。本品味辛，性溫，具有祛胃、腎寒、補腎之功效[1-2]。大托葉云實多生于山溝、路旁或草地，廣泛分布于世界熱帶地區，我國主要產于福建、廣東、廣西、湖北、湖南、海南、四川、貴州和臺灣等地[3]。據文獻報道，目前大托葉云實中含有萜類、黃酮類和甾體類化合物[4]。其中三萜類化合物具有廣泛的藥理作用和生物活性，如免疫作用、抗腫瘤、防治心血管疾病等，還可以用作食品的天然甜味劑、抗氧化劑等[5]。三萜類化合物的含量測定研究已有較多報道[6-8]。先行蒙藥材標準中對大托葉云實僅有鑒別項的規定[2-3]，有關化學成分和藥理活性方面的研究報道較少，如2015年劉輔玥等[9]對大托葉云實化學成分進行了系統研究，2016年徐晨等[10]采用柱色譜和其他分離方法對大托葉云實化學成分進行分離得到29種化合物，并采用MTT法對其中兩種化合物進行了抗腫瘤活性研究。然而，目前對于灰分檢查、顯微鑒別以及含量測定等尚缺乏統一標準。隨著蒙藥研究與應用的迅速發展，現行方法已經無法滿足大托葉云實的質量控制要求。本文以建立蒙藥材質量標準為目的，對大托葉云實的性狀、顯微鑒別與灰分檢查等項目進行系統研究，并采用香草醛-高氯酸比色法，建立大托葉云實中總三萜類化合物的分光光度含量測定方法，為其質量評價提供有效實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 藥材

大托葉云實藥材購于全國各地，詳細信息見表1，經內蒙古醫科大學生藥學教研室渠弼副教授鑒定為豆科植物大托葉云實CaesalpiniacristaL.的干燥成熟種子。

表1 大托葉云實藥材信息

1.2 儀器

旋轉蒸發儀RE52CS9(上海亞榮生化儀器廠)；KH5200DE型數控超聲儀(昆山禾創超神儀器有限公司)；SHB-B95T型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；恒溫水浴鍋B-220(上海亞榮生化儀器廠)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.3 化學試劑

對照品齊墩果酸(中國食品藥品檢定研究院，批號為 110709-201607)；水為Milli-Q超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 性狀

本品呈不規則圓形，稍扁，直徑1.5～2 cm。表面灰綠色，光滑，微具光澤，具同心性環紋，一側平截或淺凹陷，種臍點狀，淺黃白色或淺黃棕色，周圍暗褐色。質堅硬不易破碎，種皮厚約1 mm，斷面紅紫色，內皮灰白色，有稍凸起的線紋；子葉扁圓形，表面黃白色，有不規則的溝槽，質堅，斷面略平坦；具豆腥氣，味苦。

2.2 顯微鑒別

本品以種子入藥，種皮顯微結構特殊，其特征性具有鑒別意義。

種皮橫切面：表皮細胞為一列徑向延長的柵狀細胞，長90～200 μm，外被角質層，光輝帶位于中部。支持細胞1列，啞鈴形，長15～20 μm。厚壁細胞多層，不規則，外層3～6列較小，細胞內或細胞間隙常含黃棕色物質。維管束外韌型，斷續排列成環。色素細胞多層，棕色，切向延長。營養層為多層薄壁細胞,向內細胞漸小。種皮最內層細胞長方形，切向延長。見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6。

圖1 大托葉云實種皮橫切片

圖2 大托葉云實種皮柵欄細胞層

圖3 大托葉云實種皮支持細胞層

圖4 大托葉云實種皮厚細胞層

圖5 大托葉云實種皮維管束

圖6 大托葉云實種皮營養層及最內層

2.3 炮制工藝

經查閱蒙藥本草及蒙藥早年文獻，未見有關大托葉云實的特殊炮制記載。但近代文獻和《蒙藥炮制學》記載了“取仁”的方法。《蒙藥炮制文獻研究》中記載：“炒微黃或微炒，去種皮，取仁用之。”由此推斷，炒制的目的不在炒制而達到某功效，而是為去種皮取仁方便，故本文未做炮制工藝研究。經簡單對比觀察：文火炒燙(約260 ℃)大托葉云實2～3 min，篩去沙石，去種皮取仁，炮制效果較為理想。

2.4 灰分檢查

按照《中國藥典》(2015年版通則2302)灰分測定法進行測定。取供試品2～3 g，置于熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量，緩緩熾熱，至完全碳化時逐漸升高溫度至500～600 ℃，使完全灰化并至恒重。根據殘渣重量，計算供試品中總灰分的含量(%)。結果表明：7批樣品總灰分含量在4.250%～5.389%之間，平均值為4.802%，結果見表2。

表2 大托葉云實灰分含量測定

2.5 含量測定

采用紫外-可見分光光度法《中國藥典》(2015年版通則0401)對總三萜類成分含量進行測定。

2.5.1 對照品溶液制備 取齊墩果酸5.0 mg，精密稱定，置于容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液制備 取凈砂置鍋，武火加熱(約260 ℃)，投入大托葉云實，改文火炒至表面顏色加深(2～3 min)，即取出，篩去砂，放涼，剝去外皮，取仁，研細粉，過60目篩。取本品粉末0.5 g，精密稱定，置于索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙干燥至恒重，移入50 mL具塞三角瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，超聲(功率100 W，溫度25 ℃，頻率40 kHz)提取30 min，濾過，置于50 mL容量瓶中，定容至刻度，即為供試品溶液。

2.5.3 待測溶液制備 取上述對照品溶液1 mL，供試品溶液取4 mL，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，水浴揮干溶劑；各加新鮮配制的5%香草醛冰乙酸溶液1 mL、高氯酸4 mL，搖勻，閉塞，75 ℃水浴中加熱20 min，取出冷卻，置于25 mL容量瓶中，用冰乙酸定容至刻度，既得待測溶液。

2.5.4 測定條件選擇 (1)波長選擇。將上述待測溶液制備后放置20 min，用分光光度計于400～800 nm處進行光譜掃描，以不加對照品的隨行試劑為空白。結果表明齊墩果酸標準溶液與供試品溶液均在548 nm波長處有最大吸收，故選取548 nm為測定波長。

(2)5%香草醛冰乙酸溶液用量考察。精密吸取2 mL對照品溶液5份，按照“2.5.3”項下待測溶液制備方法，分別加入0.2 mL、0.6 mL、1 mL、1.4 mL、1.8 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，于548 nm處測定其吸光度分別為0.245、0.416、0.474、0.459、0.432。結果表明5%香草醛冰乙酸溶液最佳用量為1 mL。

(3)高氯酸用量考察。精密吸取2 mL對照品溶液5份，按照“2.5.3”項下待測溶液制備方法，分別加入2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL高氯酸溶液，在548 nm處測定其吸光度為0.408、0.465、0.477、0.463、0.459，結果表明高氯酸最佳用量為4 mL。

(4)水浴溫度考察。精密吸取2mL對照品溶液5份，按照“2.5.3”項下待測溶液制備方法，分別置于55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃，水浴加熱20 min，于548 nm處測定吸光度分別為0.330、0.391、0.478、0.498、0.535，雖然隨著水浴溫度的升高吸光度隨之上升，但水浴溫度高于75 ℃時，空白溶液出現顏色變化，故水浴溫度選定為75 ℃。

(5)水浴時間考察。精密吸取2 mL對照品溶液5份，按照“2.5.3”項下待測溶液制備方法，分別加熱10 min、20 min、30 min、40 min、50 min后，于548 nm處測定吸光度分別為0.367、0.477、0.512、0.578、0.768。雖然隨水浴時間的增加，吸光度隨之上升，但水浴時間超出20 min時，空白溶液出現顏色變化，故水浴時間選定為20 min。

(6)待測溶液放置時間考察。精密量取供試品溶液4 mL，按照“2.5.3”項下待測溶液制備方法制備后，在60 min內每隔5 min測一次吸光度，結果表明供試品溶液配制后在20～30 min內較穩定，30 min后穩定性下降。因此用此法測定需在配制后20～30 min內完成。

2.5.5 方法學考察 (1)標準曲線制備。精密量取對照品溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、

3.0 mL，分別置于50 mL錐形瓶中，水浴揮干溶劑，各管加入新鮮配制的5%香草醛冰乙酸溶液1 mL、高氯酸4 mL，搖勻，閉塞，75 ℃水浴中加熱20 min，取出，冷卻，移至25 mL量瓶中，用冰乙酸定容，放置20 min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見光光度法，在548 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得線性回歸方程為y=54.914x+0.0029，相關系數r=0.999，線性范圍為0.004～0.024 mg/mL。見圖7。

圖7 齊墩果酸的標準曲線

(2)精密度試驗。取配制好的對照品溶液，按照本實驗測定條件，連續測定6次，記錄吸光度值，計算其RSD值為0.4%。結果表明該方法的精密度良好，符合要求。

表2 精密度試驗結果

(3)重現性試驗。取同一批大托葉云實樣品粉末

(20161020)6份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液并測定其吸光度。結果RSD為1.0%，表明儀器重現性良好。見表3。

表3 重現性考察結果

(4)穩定性試驗。精密吸取同一批大托葉云實供試品溶液(20161020)，分別于放置0、1、2、4、8、12 h后按上述條件測定其吸光度并記錄。結果吸光度RSD為0.98%，表明樣品溶液在12 h內穩定。見表4。

表4 穩定性考察結果

(5)加樣回收試驗。稱取已知總三萜含量的大葉云實粉末(過60目篩)6份，精密稱定，分別脫脂后，加入對照品，比例為1∶0.5、1∶1、1∶1.5，繼續按照制備供試品溶液的方法制備，并在上述條件進行測定，計算回收率。結果回收率為97.14%～100.9%，平均值為98.78%，RSD為1.2%，表明該方法回收率良好。結果見表5。

表5 加樣回收率試驗結果

2.5.6 含量測定 7個不同批次樣品各取3份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，分別測定其吸光度，計算出7個批次樣品中總三萜類成分的含量，結果顯示樣品中總三萜類成分的含量為0.287%～0.346%。見表6。

表6 大托葉云實樣品中總三萜含量測定

續表6 大托葉云實樣品中總三萜含量測定

3 討論

大托葉云實種皮堅硬，難以破開，因此本文中所選的炮制工藝為經簡單對比研究決定的，僅為去種皮取仁方便，而對待測組分的含量并無明顯影響。在選擇樣品提取方法時，首先比較了超聲提取法和回流提取法，結果兩種提取方法提取率相差不大，超聲提取法操作簡單、重復性高。其次，比較了幾種提取溶劑的提取率，結果本文中所選的乙酸乙酯提取率最高，方法學更穩定，故本實驗確定了文中所述的提取方法。本文建立的測定方法簡便可行，準確性、重復性好，可用于控制大托葉云實的內在質量和用藥品質。