HPLC法同時測定坤安膏中芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷含量

李文龍，劉滿軍，曹小平，崔小敏，高曉俐，石會麗*

(1.西安市長安區醫院 中藥房，陜西 西安710100；2. 陜西省中醫藥研究院 ，陜西 西安 710003；3. 陜西省中醫醫院 制劑室，陜西 西安 710003)

坤安膏是本院婦科高曉俐大夫在30年臨床中總結的經驗方，主要用于卵巢早衰、卵巢儲備功能不足、圍絕經期綜合征、月經紊亂(月經稀少)，具有補腎填精、養血活血調經的作用。由君藥(熟地、山茱萸、枸杞子)、臣藥(丹參、淫羊藿、白芍、菟絲子、杜仲、黃精、肉蓯蓉、巴戟天、杜仲)、佐藥(五味子、黃芪、香附)、使藥(甘草)等20余味藥材組成的復方，根據治療疾病的特點，將其設定為膏滋劑制劑，用于臨床，深受患者青睞。丹參中丹酚酸B是丹酚酸之一，對心、腦、肝、腎等器官均具有重要藥理作用[1]；芍藥中芍藥苷具有顯著的鎮痛、鎮靜、抗驚厥作用[3]；淫羊藿中淫羊藿苷對免疫系統、生殖系統、核酸代謝、心腦血管系統、神經內分泌系統、抗衰老、骨代謝、抗腫瘤等具有多方面藥理作用[2]。

因此，本文用HPLC法同時進行三種成分的含量測定方法學研究，為該方藥質量控制打好實驗基礎。

1 儀器與試藥

島津LC-2010A型高效液相色譜儀，UV-VIS紫外-可見光檢測器、LC-Solution化學工作站、超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-100型)、電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，型號：BT25S，d=0.01 mg；BS210S d=0.1 mg)。乙腈為色譜純試劑，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。試驗用樣品由制劑中心提供。芍藥苷(供含量測定用，MUST-1703190-99.3%)，丹酚酸B(供含量測定用，批號：110715-20131純度98.86%)，淫羊藿苷(供含量測定用，批號：110737-200415純度98.90%)，購自中國食品藥品檢定研究院，使用前置干燥器中干燥至恒重。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷對照品分別為10.500 mg、2.925 mg、1.043 mg，分別置50 mL量瓶中，用70%甲醇溶解制成含芍藥苷0.208 53 mg/mL、含丹酚酸B 0.057 8 mg/mL、淫羊藿苷0.020 63 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取樣品(批號為20170807)約2 g，置三角瓶中，精密稱定，加70%甲醇30 mL，稱定重量，超聲處理30 min，用70%甲醇補充減失的重量，搖勻，放至室溫，離心10 min，3 000轉/min，傾出上清液，上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按照處方比例及制備工藝制備缺丹參、白芍、淫羊藿的陰性樣品，按照“2.1.2”項制備陰性對照溶液，即得。

2.2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：Akasil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸水溶液為流動相B；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min。理論塔板數按芍藥苷峰計算應不低于4 000。

表1 坤安膏中3種有效成分測定的梯度洗脫程序

2.3 專屬性實驗

分別精密移取含芍藥苷0.208 53 mg/mL、含丹酚酸B 0.057 8 mg/mL、淫羊藿苷0.020 63 mg/mL的對照品溶液、坤安膏供試品溶液及缺芍藥、丹參、淫羊藿的陰性對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下進樣分析，結果表明坤安膏供試品溶液和芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷均在相應的保留時間處出現對應的色譜峰，而缺3個藥材的陰性對照品溶液在相同保留時間處無對應的色譜峰，說明坤安膏中其他藥味對芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的測定不產生干擾。色譜見圖1。

圖1 芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷含量測定色譜

2.4 線性關系考察

精密吸取含芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的對照品混合溶液4、8、12、16、20 mL注入高效液相色譜儀，測得峰面積。分別以芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷對照品的濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，詳見表2。表明芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷進樣量在如下線性范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

表2 芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷標準曲線、r值及線性范圍

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續進樣5次，測定峰面積。結果芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.79%、0.85%、0.73%。

2.6 重復性試驗

取同一樣品(20170807)6份，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進樣測定。結果芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷含量的平均值分別為66.804 5 μg·g-1、776.600 2 μg·g-1、49.797 4 μg·g-1，RSD分別為1.96%、0.63%、1.64%。表明本法精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別在0、4、8、12、16、24 h進樣測定峰面積。結果芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為1.09%、1.0%、0.85%。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量芍藥苷(66.804 5 μg·g-1)、丹酚酸B(776.600 2 μg·g-1)、淫羊藿苷(49.797 4 μg·g-1)的同一(批號20170807)坤安膏樣品約1.0 g，共6份，精密稱定，分別精密加入含芍藥苷(64.93 μg/mL)、丹酚酸B(855.12 μg/mL)、淫羊藿苷(50.02 μg/mL)的對照品溶液1.0 mL按“2.1.2”項方法制備供試溶液，按“2.2”項色譜條件進樣測定，計算回收率。詳見表3。

表3 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.9 樣品含量測定

取三批不同批號的坤安膏樣品，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液。取供試品溶液及對照品溶液，按上述色譜條件進樣測定，用外標兩點法計算含量。詳見表4。

表4 三批坤安膏樣品中芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的含量測定結果 (μg/g)

3 討論

3.1 供試品前處理工藝的考察[4-9]

依據處方中君臣佐使、含有的藥味及其所含成分的理化性質，分別考察了以70%甲醇、50%的乙醇、100%甲醇、100%乙醇作為提取溶劑、提取次數、提取體積及提取方式(回流、超聲)等前處理工藝，發現用70%的甲醇，加入15倍量，超聲30 min提取，離心10 min(3 000轉/min)所得的供試品溶液，結果芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的平均回收率分別為101.47%、100.47、100.20%。故選用此法處理。

3.2 色譜柱的確定[8-12]

最初采用Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Zorbax Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm ，5 μm)色譜柱，由于丹酚酸B酸性較強 ，增大流動相中甲酸比例至pH=3時，色譜峰仍有拖尾，而pH過低對色譜柱的損害較大，考慮各種型號色譜柱的適用性，采用Akasil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱試驗，結果峰形大為改善，分離度、理論塔板數、拖尾因子均符合系統適應性試驗要求，故最終確定采用Akasil-C18色譜柱。

3.3 流動相的優化[9-12]

由于坤安膏組成藥味多，且已知成分有限，各成分性質差異較大，為使3種有效成分達到良好分離效果，本實驗分別考察了不同的流動相配比，甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，甲醇-乙腈-甲酸-水(29∶9∶0.1∶60.9)，甲醇-乙腈-甲酸-水(18∶19∶1∶62)，甲醇-乙腈-甲酸-水(17∶18∶0.1∶64.9)，乙腈-水、乙腈-0.1%(體積分數)醋酸、甲酸、磷酸等為流動相系統對色譜條件進行考察，但分離效果均不甚理想。如以乙腈-0.1%(體積分數)磷酸水溶液為流動相時，芍藥苷、丹酚酸B出峰好，但淫羊藿苷保留時間過長，而且雜質分離效果差，峰形較差。經過進一步對比研究，最終選擇乙腈-0.1%(體積分數)磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，可消除雜質對被測成分的干擾，各成分的色譜峰峰形對稱、理論塔板數高、分離度好、拖尾因子均達到要求，縮短了多成分檢測的分析時間。

3.4 波長的選擇[9-14]

根據文獻資料，芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷分別在230、286、270 nm波長處有最大吸收，但因本復方成分十分復雜，影響因素較多，本實驗分別在230、286、270 nm波長處進行了樣品測試，結果發現在230 nm波長處，出現峰信息較多，3種主成分分離效果較好，因此選擇230 nm作為檢測波長，可同時得到3種成分較好的色譜峰，并能滿足定量測定的要求。

目前還未見有文獻報道將芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷3種成分同時采用HPLC法進行含量測定，本文所確定的方法操作簡便、重復性好、準確穩定，能快速、準確地對坤安膏中的芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷3種成分同時進行定量測定，為該制劑控制坤安膏質量提供了重要參考，同時也為芍藥、丹參、淫羊藿三種藥材同時存在的復方進行質量控制，作為實驗參考。