化瘀祛痰方對急性心肌缺血大鼠心肌組織RhoA、ROCK1 mRNA 表達的影響

李陽， 冷雪

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，遼寧沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，遼寧沈陽 110847）

急性心肌缺血是由于心臟血液灌注減少，導(dǎo)致心臟供氧降低、心肌能量代謝不正常、不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)，是冠心病等多種心臟疾病的常見癥狀[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，其發(fā)病機制與血管舒縮功能[2]、血液流變學(xué)[3]、心肌耗氧量[4]等有關(guān)，其中RhoA/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）信號通路是調(diào)整血管舒縮功能與血流量的熱點通路。前期研究表明，化瘀祛痰顆粒可以通過保護心肌超微結(jié)構(gòu)，抑制心電圖J點的抬高，減少J點的回落時間，增加微循環(huán)血管橫截面積，提高血液中一氧化氮（NO）的濃度，降低血液中內(nèi)皮素1（ET-1）的濃度來阻抑血小板活化，防止血管痙攣，預(yù)防血栓的形成，從而最終起到改善心肌微循環(huán)的作用[5]。基于此，為進一步探討化瘀祛痰方防治急性心肌缺血的作用機制，本研究觀察其對急性心肌缺血大鼠心肌組織RhoAROCK1信號通路的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物60只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，7周齡，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲水，自然光照。

1.2藥物與試劑化瘀祛痰方由黨參25 g，黃芪25 g，絞股蘭15 g，丹參5 g，茯苓10 g，法半夏、石菖蒲、川芎、郁金各5 g組成，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供；單硝酸異山梨酯片（魯南貝特制藥有限公司）。異丙腎上腺素（Iso）（美國Sigma公司）；大鼠ET-1酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（上海艾萊薩生物科技有限公司）；TRlzon總RNA提取試劑、HiFiScript cDNA Synthesis Kit、UltraSYBR Mixture（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

1.3主要儀器SpectraMax I3多功能酶標(biāo)儀（奧地利Molecular Devices公司）；96-Well梯度PCR擴增儀（美國Veriti公司）；7500熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）；PL3508八通道生理記錄儀（澳大利亞AD公司）。

1.4分組與給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機將大鼠分為空白組，模型組，西藥組，中藥低、中、高劑量組，每組10只。西藥組給予單硝酸異山梨酯水溶液灌胃，中藥低、中、高劑量組分別對應(yīng)給予低、中、高劑量的化瘀祛痰方灌胃，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。化瘀祛痰方劑量按照動物與成人（體質(zhì)量60 kg）的每kg體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表計算（人與大鼠的折算系數(shù)為6.25）。化瘀祛痰方低、中、高劑量分別為10.4、20.8、41.6 g·kg-1·d-1。單硝酸異山梨酯片劑量為3.125 mg·kg-1·d-1，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5動物模型復(fù)制參考楊勇等[6]方法造模。實驗第7天，給予各組大鼠灌胃給藥后30 min，腹腔注射100 g/L水合氯醛，待麻醉成功后使其仰臥于兔臺上，除正常組外，給予其余各組大鼠腹腔注射Iso（0.025 mL/kg）復(fù)制急性心肌缺血模型，正常組大鼠注射等體積生理鹽水。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 心電圖 造模前將大鼠麻醉，后連接八通道多導(dǎo)生理記錄儀并將電極插入大鼠四肢皮下，記錄大鼠正常心電圖。待心電圖穩(wěn)定后注射Iso復(fù)制急性心肌缺血模型，再記錄2、5、10、15、20、30 min大鼠標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化。計算2、5、10、15、20、30 min心電圖ST段偏移的幅度，每個時間點測5個心動周期，取其平均值，以模型組大鼠心電圖6個時間點的ST段偏移絕對值之和大于等于0.6 mV作為急性心肌缺血造模成功的標(biāo)志[7]。

1.6.2 心肌病理學(xué)觀察 取100 g/L多聚甲醛固定的心肌組織，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、梯度入水、蘇木素—伊紅（HE）染色、晾干、封片、鏡檢。

1.6.3 ELISA法檢測各組大鼠血清ET-1含量 測定大鼠心電圖后腹主動脈采血，靜置2 h，4℃3 000 r/m離心10 min，分離血清，-20℃冷凍備用。具體步驟嚴(yán)格按照ET-1 ELISA試劑盒說明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及光密度（OD）值計算各組大鼠血清ET-1含量。

1.6.4 qPCR法檢測各組大鼠心肌組織RhoA、ROCK1 mRNA水平 稱取0.1 g心肌組織，采用Trizol法提取RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄體系：dNTP Mix 4 μL+Primer Mix 2 μL+RNA+5 × RT Buffer+DTT 2 μL+HiFiScript 1 μL+RNase-Free Water 共 20 μL，以37℃15 min、85℃5 s的條件進行反轉(zhuǎn)錄。PCR體系：2× UltraSYBR Mixture 25 μL+Template DNA 2 μL+上下游引物 各1 μL+RNase-Free Water 21 μL共50 μL，按照95℃ 30 s，1個循環(huán)，變性95℃5 s，60℃34 s，35個循環(huán)的條件進行擴增，得到各孔對應(yīng)的CT值。采用2-△△CT法，以模型組為1，計算RhoA、ROCK1 mRNA的相對表達水平（p）。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，若正態(tài)分布、方差齊性，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)比較圖1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組心肌纖維大片斷裂，間質(zhì)可見明顯出血；與模型組比較，西藥組，中藥低、中、高劑量組心肌纖維斷裂改善，間質(zhì)出血減少。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化比較（HE，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of myocardial tissues in various groups（by HE staining，× 400）

2.2各組大鼠心電圖ST段偏移比較表2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組心電圖ST段偏移值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組心電圖ST段總偏移值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心電圖ST段總偏移值比較Table 2 Comparison of the total ST-segment deviation in ECG of various groups ()

表2 各組大鼠心電圖ST段總偏移值比較Table 2 Comparison of the total ST-segment deviation in ECG of various groups ()

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

N組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組10 10 10 10 10 10 ST段總偏移（V/mV）0.13±0.05 0.91±0.07①0.29± 0.09①②0.57± 0.08①②0.43± 0.11①②0.35± 0.08①②

2.3各組大鼠血清ET-1含量比較表3結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組血清ET-1含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組血清ET-1含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清ET-1含量比較Table 3 Comparison of the serum content of ET-1 in various groups ()

表3 各組大鼠血清ET-1含量比較Table 3 Comparison of the serum content of ET-1 in various groups ()

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組ET-1[ρ/（μg·L-1）]233.53±27.21 328.63±29.16①296.43±33.64②268.15±45.64②259.12±38.19②271.64±46.29②N 10 10 10 10 10 10

2.4各組大鼠心肌組織RhoA、ROCK1 mRNA水平比較表4結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組RhoA mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組RhoA mRNA表達水平均降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組、西藥組ROCK1 mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組ROCK1 mRNA表達水平均降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠心肌組織RhoA、ROCK1 mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1 in myocardial tissues of various groups（，p）

表4 各組大鼠心肌組織RhoA、ROCK1 mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1 in myocardial tissues of various groups（，p）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組N RhoA mRNA 0.13±0.04 ROCK1 mRNA 0.10±0.01 10 10 10 10 10 10 1①1①0.53± 0.04①②0.21±0.03②0.24±0.07②0.16±0.06②0.34± 0.09①②0.33±0.02②0.21± 0.02①②0.18± 0.07①②

3 討論

一般認(rèn)為“脾虛生痰、痰瘀互結(jié)”是心肌缺血的基本病機[8]。脾虛則痰濁內(nèi)生，氣血津液化生障礙，痰瘀阻絡(luò)，導(dǎo)致氣機不利，氣滯則血瘀，痰瘀互結(jié)，血脈閉阻，從而引發(fā)心肌缺血，出現(xiàn)胸悶、頭暈?zāi)垦！⑻刀喽场⑹成偌{呆、舌質(zhì)暗、苔膩，舌下絡(luò)脈迂曲、脈弦、滑或澀等痰瘀癥狀[9]。化瘀祛痰方由黨參、黃芪、丹參、絞股藍、茯苓、石菖蒲、郁金、川芎、法半夏等組成。方中黨參、絞股藍健脾益氣，配以茯苓健脾滲濕，使?jié)駸o所聚，痰無由生；丹參、川芎活血祛瘀，佐以石菖蒲、郁金、法半夏，化痰和胃，活血行氣，使氣機暢通。諸藥合用，使瘀化則津液自通，痰邪自散，痰散則脈絡(luò)通利，瘀不能生，具有益氣健脾、祛痰化瘀之功效[10]，與“脾虛生痰、痰瘀互結(jié)”之心肌缺血證候相合。但其具體作用機制尚不明確。

有研究表明，急性心肌缺血的發(fā)生與RhoA/ROCK通路密切相關(guān)[11]。RhoA/ROCK1信號通路是心血管疾病研究的新靶點，激活該通路具有抑制血管收縮、調(diào)整內(nèi)皮功能的作用[12]。其中ET-1是強烈的收縮血管的物質(zhì)，是RhoA/ROCK信號通路重要的激活因子[13]。RhoA是Rho 3個亞型中研究最多的一個[14]。ROCK是RhoA激酶，分為ROCK1和ROCK2 2個亞型，ROCK1在心肌、血管、肺、脾、肝、腎中表達，其調(diào)控平滑肌收縮的主要底物是肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）[15]。正常情況下，ET-1通過刺激G蛋白偶聯(lián)受體使與GDP結(jié)合的RhoA轉(zhuǎn)化為與GTP結(jié)合的RhoA，當(dāng)RhoA被激活后傳遞活化信號活化ROCK1，使MLCP磷酸化，促使肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化程度升高，心肌收縮[16]。

本研究結(jié)果顯示：急性心肌缺血模型大鼠心肌組織出現(xiàn)纖維大片斷裂，間質(zhì)明顯出血，血清ET-1含量與心肌組織RhoA、ROCK1 mRNA表達水平升高。提示造模過程中可能過度激活了RhoA/ROCK1通路，促使心肌異常收縮，心肌血流量減少，引起心肌缺血。而經(jīng)7 d的預(yù)灌胃給藥后，中藥各劑量組心電圖ST段總偏移值降低，心肌組織纖維斷裂及間質(zhì)明顯出血的情況明顯改善，大鼠血清ET-1含量與心肌組織RhoA、ROCK1 mRNA表達水平下降。提示化瘀祛痰方對急性心肌缺血大鼠具有防治作用，其機制可能與抑制大鼠心肌RhoA/ROCK1信號通路相關(guān)蛋白RhoA、ROCK1 mRNA表達，抑制心肌收縮，增大心肌血流量有關(guān)。

綜上所述，化瘀祛痰方可能是通過降低大鼠血清ET-1含量，降低RhoA/ROCK1信號通路中RhoA、ROCK1 mRNA表達水平，改善急性心肌缺血的心肌組織結(jié)構(gòu)，達到防治急性心肌缺血的目的。