超高效液相色譜法測定不同配伍比黃芪—葛根藥對中葛根素的含量

林靜瑜， 李東曉， 戴雅彬， 黃可兒

（1.福建省中醫藥研究院，福建福州 350003；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；3.福建衛生職業技術學院，福建福州 350101）

黃芪—葛根藥對出自于《證治匯補》卷三之黃芪葛根湯，方中著有“黃芪一兩、葛根五錢”，用于“酒郁”，《醫略六書》將此方作為“虛人傷酒惡寒之專方”，清代張錫純玉液湯以“黃芪五錢、葛根一錢半”組方治消渴，現臨床多用于治療氣陰兩虛的糖尿病及其并發癥和痹癥等[1-3]。中藥是復雜化學成分的載體，藥對是研究中藥復方的最基本單位，不同配伍規律的藥對共煎煮后，其化學成分及成分的比例可能會產生較大的變化，從而導致藥理活性的改變[4-6]。課題組前期研究發現，黃芪—葛根藥對改善胃黏膜損傷效果不錯，且在配伍比例不變時，其胃黏膜保護作用與不同水煎工藝所得的葛根素含量有一定的相關性[7，8]。葛根素為中藥野葛的質控成分，藥理研究證實葛根素具有一定的胃黏膜保護作用[9，10]。為進一步探討黃芪、葛根藥對配伍規律對其胃黏膜保護藥效物質的影響，本研究以葛根素含量為評價指標，采用超高效液相色譜—紫外（UPLC-UV）法研究不同配伍比例的黃芪、葛根水煎后葛根素含量的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1儀器ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀（包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、EmpowerⅢ色譜工作站，Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱（美國Waters公司）；SB-5200DT超聲清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AEG-220電子分析天平（日本島津公司）；Direct-Q3型高純水制備儀（美國Milipore公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2藥品與試劑黃芪（產地甘肅，南京同仁堂中藥飲片有限公司，批號：20180908），葛根（南京同仁堂中藥飲片有限責任公司，批號：20170701），黃芪、葛根飲片由福建中醫藥大學中藥鑒定教研室車蘇容副教授鑒定，分別為豆科植物 蒙 古 黃 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的根、豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwir的根；葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-201514，純度95.5%）；甲醇（德國Merck公司，色譜純）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1對照品溶液和供試品溶液的制備

2.1.1 葛根素對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成濃度1.021 mg·mL-1的葛根素對照品液，4℃貯存，備用。

2.1.2 黃芪—葛根藥對供試品溶液的制備 參照文獻[6]水煎工藝，取黃芪、葛根藥材各適量，制備8個不同配伍比黃芪—葛根藥對水煎液（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2、1∶3、1∶5），總藥材量固定為100 g，水煎濃縮為1 g·mL-1。取水煎液1 mL，加4 mL蒸餾水稀釋，混合均勻。精密吸取水煎稀釋液5 mL置于錐形瓶中，加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷；加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過；精密吸取續濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得各配伍比供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備 取黃芪藥材適量，按“2.1.2”供試品溶液制備方法制備不含葛根的黃芪水煎液，作為陰性供試品溶液。

表1 不同配伍比黃芪—葛根藥對組成Table 1 Different compatibility ratios of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair

2.2方法學考察

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇—0.1%冰醋酸水溶液（29∶71）；流速：0.2 mL·min-1；檢測波長：250 nm；柱溫：30℃；進樣量：2 μL，理論塔板數按所測葛根素色譜峰計算不低于6 000。

2.2.2 專屬性試驗 精密吸取“2.1.1”制備的葛根素對照品溶液、陰性供試品溶液及黃芪—葛根藥對水煎液（2∶1，批號：20181022）供試品溶液各2 μL，注入色譜儀，按“2.2.1”色譜條件分析，記錄葛根素對照品、供試品的色譜圖及保留時間。結果顯示：葛根素的保留時間約為8.6 min，此色譜條件下黃芪—葛根藥對水煎液中葛根素峰形良好，出峰時間穩定，具有良好的專屬性，葛根素對照品溶液和供試品溶液在同一保留時間處出峰，陰性供試品溶液沒有色譜峰出現，見圖1。

2.2.3 線性關系考察 精密吸取葛根素對照品液，加甲醇分別配制成0.816 8 mg·mL-1、0.510 5 mg·mL-1、0.255 3 mg·mL-1、0.127 6 mg·mL-1、0.063 8 mg·mL-1、0.031 9 mg·mL-1的標準溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件進行分析，記錄保留時間和峰面積。以對照品溶液濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得線性回歸方程Y＝5.989 5×107X-1.832 7×106（r＝0.999 7），結果表明葛根素在濃度0.031 9～0.816 8 mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取葛根素對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖，并計算其峰面積相對標準偏差（RSD，sR）為0.85%，結果表明儀器精密度符合要求。

2.2.5 重復性考察 精密吸取黃芪—葛根藥對水煎液（2∶1，批號：20181022）1 mL，按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法平行操作6次，按“2.2.1”色譜條件進行測定并記錄色譜圖，計算葛根素含量，結果其sR為2.62%，表明該方法重復性符合要求。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取同一黃芪—葛根藥對水煎液，按“2.1.2”供試品溶液制備方法制得供試品溶液，于制備后0、2、6、8、10、12、24 h分別取同一供試品溶液2 μL進樣，在“2.2.1”同一色譜條件測定葛根素峰面積，計算葛根素峰面積sR為0.25%，表明樣品在24 h內穩定。

2.2.7 加樣回收率 吸取上述已知葛根素含量的黃芪—葛根藥對水煎稀釋液（2∶1，批號：20181022）適量（含葛根素1.401 3 mg）， 共6份，置于錐形瓶中。按1∶1比例加入葛根素對照品溶液，搖勻，按“2.1.2”項下方法制得供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件方法進樣2 μL。計算加樣回收率，結果平均回收率為96.11%，sR為1.28%，見表2。

圖1 葛根素對照品及黃芪—葛根藥對水煎液色譜圖Figure 1 UPLC.Results of puerarin reference and the decoction of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair

2.2.8 含量測定 按“2.1.2”項下方法，平行制備5份8個不同配伍比黃芪—葛根藥對（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2、1∶3、1∶5）供試品溶液。按“2.2.1”項下葛根素的色譜條件方法進樣2 μL，測定葛根素峰面積，代入“2.2.3”線性方程中，計算各藥對水煎液中葛根素的平均質量濃度及平均含量。葛根素質量濃度及含量數據以均數±標準差()表示，采用SPSS 15.0統計軟件進行統計學分析。各組資料若符合正態分布，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性，采用Dunnett-t檢驗，方差不齊時，采用Dunnett'sT3檢驗。結果顯示：與黃芪—葛根藥對0∶1配伍比組（葛根單煎液）相比，加入黃芪的各配伍比組葛根素含量均有增加的趨勢，并隨黃芪在藥對中比例的增高而上升，但非倍增關系。其中，藥對以5∶1配伍時，葛根素含量最高，配伍比為3∶1、2∶1、1∶1時次之（與0∶1配伍比組比較，均P＜0.01）。見表3。

表2 葛根素加樣回收率試驗Table 2 The recovery.Results of puerarin

表3 不同配伍比黃芪—葛根藥對水煎液中葛根素的含量測定Table 3 Comparison of the puerarin content of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair with different compatibility ratios（n=5）(-x ± s)

3 討論

3.1色譜條件的選擇《中國人民共和國藥典》（2015）規定野葛藥材中葛根素含量不低于質量分數2.4%。本研究采用超高效液相色譜—紫外法檢測葛根素，通過分析供試品特征圖譜，發現黃芪—葛根藥對水煎液的相關成分紫外吸收主要集中在220～350 nm處，且葛根素在250 nm處有最大吸收。同時考察了甲醇—水，甲醇—0.1%醋酸水溶液、乙腈—水和乙腈—0.1%醋酸水溶液等流動相系統，結果顯示：以甲醇—水為流動相時，葛根素色譜峰拖尾嚴重，而以乙腈代替甲醇，葛根素色譜峰峰型較好，但與其他成分色譜峰分離度差。若以0.1%的醋酸代替水，葛根素峰型較好且分離度好，最終確定“2.2.1項”下色譜條件。

3.2黃芪—葛根藥對的不同比例配伍對葛根素濃度、煎出量的影響劑量與配伍比是中藥組方的一個重要環節，其合理性也逐漸得到現代科學的驗證。黃芪—葛根藥對常見配伍比主要有1∶1、2∶1、3∶1或其近似值，葛根比例高于黃芪則較少見。研究報道：黃芪和葛根配伍時，大多數成分的溶出量較單煎時高[11]。本研究側重考察黃芪—葛根藥對配伍比例對葛根素煎出量的影響，研究結果（表3）顯示：①黃芪—葛根藥對中葛根素的濃度隨著葛根比例的增高而上升，但無倍增關系，以0∶1配伍比組（葛根單煎液，葛根比例為100%）最高，5∶1配伍比組（葛根比例為16.7%）最低；②黃芪—葛根藥對中黃芪對葛根素的煎出量有明顯的促進作用，葛根素的煎出量隨著黃芪在藥對中比例的增高而呈波段式上升，以5∶1配伍時（黃芪比例為83.3%）葛根素煎出量最高，3∶1、2∶1次之，1∶1居中，1∶2、1∶3、1∶5 3個配伍比組中葛根素的煎出量較低，但仍呈高于葛根單煎液的趨勢，說明黃芪對葛根素的煎出量影響明顯；③黃芪—葛根藥對水煎液中葛根素濃度同時受藥對中葛根的比例及黃芪的配伍的影響。該部分結果與佟志斌等[12]的研究結果稍有不同，可能與本研究所采用的葛根來源、水煎工藝及處理方法等不同有關。

黃芪葛根湯中黃芪為“君”，葛根為“臣”，屬“七情”中“相須”、“相使”配伍，不同的配伍比例對黃芪—葛根藥對葛根素的含量存在明顯的影響，說明臨床黃芪—葛根藥對的配伍應用確有其合理性。本研究僅就不同配伍比黃芪—葛根藥對中葛根素的含量變化進行探討。黃芪、葛根及其指標成分的配伍在藥理和化學層次上是否存在相似的協同作用？我們將在后續工作中繼續考察黃芪—葛根藥對的配伍關系對其他指標成分的影響，并結合藥效實驗評價黃芪—葛根藥對保護胃黏膜的作用基礎。