β-細辛醚減少美多芭在PD 模型大鼠中的使用劑量

寧百樂， 張芹欣， 鄧敏貞， 王南卜， 方永奇

（1.廣東省中醫院、廣州中醫藥大學第二臨床醫學院、廣東省中醫藥科學院，廣東廣州 510120；2.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種常見的神經系統退行性疾病，其患病率為神經系統退行性疾病的第2位，全球患病率為400～1 900/10萬[1，2]。我國65歲以上人群的患病率為1 700/10萬，并隨年齡增長而升高，給家庭和社會帶來沉重的負擔[3]。該病的主要病理改變為黑質致密部多巴胺能神經元丟失和α-突觸核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）異常積聚形成路易小體，其主要生化改變為紋狀體區多巴胺（dopamine，DA）等神經遞質降低，臨床癥狀包括靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢平衡障礙等運動癥狀及嗅覺減退、睡眠障礙、便秘和抑郁等非運動癥狀。目前PD的發病機制仍沒有明確，使探尋治療PD療法的道路困難重重。

目前，治療本病的方法和手段包括藥物治療、手術治療、運動療法、心理疏導及照料護理等。藥物治療為首選，且是整個治療過程中的主要治療手段。手術治療則是藥物治療的一種有效補充。藥物治療雖可暫時緩解癥狀，但不良反應亦較明顯，并易產生耐藥[4]。幸運的是，中醫藥治療PD可持續改善癥狀，減輕西藥不良反應，降低耐藥性，與西藥合用可提高療效。石菖蒲作為醒腦開竅的代表藥物被用于PD的治療，它具有開竅豁痰、醒神益智、化濕辟穢的功效。現代研究表明，石菖蒲揮發油的主要有效成分為β-細辛醚，它分子量小，親脂性高，在體內吸收快、分布快[5]，能快速通過血腦屏障，在腦組織內分布廣泛[6，7]。我們前期發現β-細辛醚能夠改善6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導的PD模型大鼠的行為學，升高紋狀體內高香草酸（HVA）、DA及5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）的含量，還可以降低α-syn的含量，同時促進腦內的酪氨酸羥化酶（TH）的表達[8]；此外，β-細辛醚能夠促進左旋多巴（L-DOPA）入腦，升高腦內DA的含量[9]。美多芭是臨床上治療PD的常用藥物，能夠有效改善PD的臨床癥狀，但是隨著應用時間的延長，多會出現療效減低和不隨意運動等副作用。如何延長美多芭的應用時間，減輕美多芭引起的副作用，是當前研究的熱點問題。因此，本研究觀察β-細辛醚聯合低劑量美多芭對6-OHDA誘導的PD模型大鼠的行為學、DA等神經遞質、DA合成酶及肝腎功能和組織病理學的影響，探討聯合用藥后，能否減少美多芭的使用劑量，療效是否與單獨使用美多芭相當，是否能減輕肝腎功能的損害。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康成年SPF級SD大鼠70只，雌雄各半，220～250 g，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0034。實驗方案經過廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會同意（TCMF1-2015024）。

1.2藥物與試劑石菖蒲，購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院，產地四川，經鑒定為天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根莖，批號：150501；美多芭，上海羅氏制藥有限公司，批號：SH2244。阿撲嗎啡（APO）標準品，上海瑞齊生物科技有限公司，批號：100839-201212；維生素C片，廣東華南藥業集團有限公司，批號：150105；6-OHDA，上海源葉生物科技有限公司，貨號：YY12246；水合氯醛，天津市福晨化學試劑廠，批號：20140512；Anti-tyrosine hydroxylase antibody，美國Abcam公司，貨號：ab137869；Goat anti-rabbit IgG，FITC conjugated，北京康為世紀生物科技有限公司，貨號：CW0114；DA標準品，上海源葉生物科技有限公司，CAS：62-31-7；左旋多巴標準品，中國食品藥品檢定研究院，貨號：100170-200303；高香草酸標準品，成都曼斯特生物科技有限公司，貨號：must-12122301；5-羥色胺標準品，成都曼斯特生物科技有限公司，貨號：Must-12122605；3，4-二羥苯乙酸標準品，美國Sigma-Alorich公司，貨號：1451791V；多巴脫羧酶（DDC）酶聯免疫吸附分析（ELISA）（血清）試劑盒，加拿大Elixir醫藥公司，批號：D085SC；DDC ELISA（組織）試劑盒，加拿大ELIXIR醫藥公司，批號：D085FC；磷酸二氫鉀，廣州化學試劑廠，批號：20150123；甲醇（色譜純），德國Merck公司，CAS：67-56-1；乙腈（色譜純），德國Merck公司，CAS：75-05-8；4%多聚甲醛，北京康為世紀生物科技有限公司，貨號：DF0135；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）的ELISA（血清）試劑盒（批號：C009-2）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的ELISA（血清）試劑盒（批號：C010-2）、肌酐（Cr）的ELISA（血清）試劑盒，（批號：C011-2）、血尿素氮（BUN）的ELISA（血清）試劑盒（批號：C013-2）、總膽紅素（TBIL）ELISA（血清）試劑盒（批號：C019-1），南京建成生物工程研究所。

1.3儀器腦立體定位儀，美國STOELTING公司；疲勞轉棒儀，成都泰盟科技有限公司，型號：ZB-200；曠場箱，自制；高效液相色譜儀，美國Waters公司，型號：Waters-2695；Symmetry色譜柱（150 mm×4.6 mm），美國 Waters公司，Lot NO.0291351623；針筒式微孔濾膜過濾器，天津市騰達過濾器廠，規格：直徑25 mm，孔徑0.45 μm；Multiskan MK3酶標儀，美國Thermo Scientific公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：AE-200；3K30低溫高速離心機，美國Sigma公司；ARATHON牙科鉆，SAEYANG公司；流式細胞儀，Beckman公司，型號：FC 500。

1.4藥物制備石菖蒲揮發油的制備：按照2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄揮發油的提取方法提取揮發油。稱取石菖蒲，加8倍量的水，煎煮8 h，收集揮發油備用。β-細辛醚單體的制備：取石菖蒲揮發油，采用冷凍結晶法進行純化和分離得白色晶體。β-細辛醚單體純度的檢測：用氣質聯用法證實其純度為99%以上[10]。

1.5 PD模型制備在給予大鼠100 g/L水合氯醛（劑量為350 mg/kg）麻醉的狀態下，于左側前腦內側束內，單點注射6 μL（質量濃度為4 g/L）的6-OHDA， 坐 標 為 tooth bar： -2.3 mm， antero-Posterior： -4.4 mm，medio-lateral：1.2 mm，dorsoventral：-7.8 mm[11]。假手術組 10 只大鼠注射 6 μL的0.2 g/L維生素C生理鹽水。造模1個月后，將腹腔內注射劑量為0.5 mg/kg的阿撲嗎啡（APO），且出現在水平地面轉圈，向健側旋轉圈數大于7圈/min的大鼠判斷為成功PD模型。

1.6分組與給藥將造模成功的大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為模型組（蒸餾水，劑量為1 mL/100 g）、美多芭組（美多芭，劑量為75 mg/kg）、β-細辛醚組（β-細辛醚，劑量為15 mg/kg）、β-細辛醚+1/4美多芭組（β-細辛醚15 mg/kg+美多芭18.75 mg/kg）、β-細辛醚+1/2美多芭組（β-細辛醚15 mg/kg+美多芭37.5 mg/kg）和β-細辛醚+美多芭組（β-細辛醚15 mg/kg+美多芭75 mg/kg）。每天分2次灌胃給藥，給藥30 d。本課題組研究β-細辛醚多年，認為15 mg/kg的β-細辛醚最為合理。

1.7行為學檢測各組大鼠在給藥第28天進行自主運動功能測試（曠場實驗）、平衡能力與協調性測試（轉棒實驗）和感覺運動整合功能測試（前肢實驗）的適應性實驗。在給藥第29、30天進行正式的行為學檢測。檢測前，每只大鼠要適應5 min。曠場實驗：自制60 cm×60 cm×40 cm的木箱，底部以10 cm×10 cm劃分，將大鼠放在中央格內，記錄大鼠的移動格子數，站立次數和中央停留時間；轉棒試驗：將大鼠放在疲勞轉棒儀上，記錄大鼠在轉棒上的停留時間；前肢實驗：記錄右前肢的啟動時間。

1.8取材第31天，將各組大鼠用100 g/L水合氯醛（劑量為350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，打開大鼠的胸腹腔，腹主動脈取血，用9.0 g/L生理鹽水心臟灌注（直到大鼠的肺完全變白為止），取肝腎，隨后開顱取腦，分離紋狀體和中腦，稱質量記錄，放入相應編號的離心管，紋狀體置于-80℃備用。

1.9觀察指標與方法

1.9.1 高效液相色譜（HPLC）法測定紋狀體內單胺類神經遞質L-DOPA、DA、3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、5-羥色胺（5-HT）、5-HIAA、HVA的含量 將紋狀體按1 mg∶5 μL加入5%高氯酸，電動勻漿，離心（12 000 g，4℃）10 min后將上清液過濾放置于相應編號的樣品瓶中，置于4℃待測。色譜條件：流動相0.1 mol/L KH2PO4∶甲醇=80∶20，Waters Symmetry色譜柱（150 mm ×4.6 mm），柱溫30℃，流速1 mL/min，激發波長280 nm，發射波長330 nm，進樣量20 μL。

1.9.2 HPLC測定血清單胺類神經遞質DA的含量 取血清500 μL于相應編號的離心管中，按1∶1（v/v）加入500 μL 5%高氯酸，渦旋混勻，離心（12 000 g，4℃）10 min后將上清液過濾放置于相應編號的樣品瓶中，置于4℃待測。色譜條件：流動 相 0.1 mol/L KH2PO4∶甲 醇 =80∶20， Waters Symmetry色譜柱（150 mm×4.6 mm），柱溫30℃，流速1 mL/min，激發波長280 nm，發射波長330 nm，進樣量20 μL。

1.9.3 ELISA檢測血清和中腦內DDC的含量 取血清和中腦組織，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟，檢測DDC的含量。

1.9.4 流式細胞術測定中腦內TH的表達率 取各組新鮮中腦組織加入PBS 1 mL，用小剪刀剪碎組織（約100次），用吸管吹勻（約50次），用吸管吸出上液于100目篩網上；濾液用300目濾網過濾到流式管，離心（1 140 r/min，5 min），去上清液，加入PBS 1 mL，離心，去上清液，再加入PBS 1 mL，重復上述操作1次，根據指標加入2 mL的PBS。

取單細胞懸液（1×106/mL）加入封閉液（含體積分數2%胎牛血清的PBS液）2 mL，搖勻后室溫放置15 min，搖勻后均分到各個指定的指標管中。離心去上清液，加入固定劑A 100 μL，搖勻后室溫固定15 min，加入1 mL封閉液洗1次。離心去上清液，加入破膜劑B 100 μL，一抗100 μL，搖勻后室溫避光孵育30 min，PAB洗1次。離心去上清液，加入二抗100 μL，搖勻后避光孵育20 min，PBS洗1次，離心去上清液，加入10 g/L多聚甲醛1 mL固定，封口待測。

1.9.5 肝腎功能檢測 取各組大鼠的血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，對ALT、AST、Cr、BUN和總膽紅素進行檢測。

1.9.6 肝腎病理學檢測 取各組大鼠的肝腎組織，脫水，進行蘇木素—伊紅（HE）染色，封片，在顯微鏡下進行病理學觀察。

1.10統計方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，數據采用均數±標準差()表示，各組

別之間數據比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統計學檢驗，若方差齊性檢驗P＞0.05，兩兩之間比較采用LSD，否則兩兩之間比較采用Dunnett's test，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1行為學結果表1結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠移動格子數、站立次數和轉棒停留時間明顯減少（P＜0.05），中央格停留時間和右前肢啟動時間明顯增加（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，各治療組移動格子數、站立次數和轉棒停留時間均增加，中央格停留時間和右前肢啟動時間明顯減少，除β-細辛醚組移動格子數、站立次數，β-細辛醚+1/4美多芭組站立次數差異無統計學意義（P＞0.05）外，各治療組其余指標差異均有統計學意義（P＜0.05）。與美多芭組比較，β-細辛醚+1/2美多芭組、β-細辛醚+美多芭組大鼠的移動格子數，β-細辛醚+美多芭組大鼠的中央格停留時間，β-細辛醚+1/4美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚+美多芭組的大鼠站立次數轉棒停留時間、右前肢啟動時間差異均無統計學意義（P＞0.05）。表明β-細辛醚聯合小劑量美多芭對PD模型大鼠的行為異常有改善作用，且療效與常規劑量美多芭療效相當。

2.2 β-細辛醚聯合美多芭對6-OHDA誘導的PD模型大鼠紋狀體內神經遞質的影響表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠的DA、DOPAC和5-HT含量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚+美多芭組大鼠L-DOPA含量明顯增加（P＜0.05），美多芭組、β-細辛醚+1/4美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚+美多芭組大鼠的DA和DOPAC含量明顯增加（P＜0.05），β-細辛醚+1/4美多芭組和β-細辛醚+1/2美多芭組大鼠的5-HT含量明顯增加（P＜0.05）；與美多芭組大鼠比較，β-細辛醚+1/2美多芭組大鼠的L-DOPA含量，β-細辛醚組、β-細辛醚+1/4美多芭組和β-細辛醚+美多芭組大鼠的DA含量，β-細辛醚+1/4美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚+美多芭組大鼠的DOPAC含量，β-細辛醚組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚組+美多芭組大鼠的5-HT含量，β-細辛醚組、β-細辛醚+1/4美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚+美多芭組大鼠的5-HIAA和HVA含量均無明顯差異（P＞0.05）。表明PD模型大鼠紋狀體內神經遞質含量減少，β-細辛醚聯合不同劑量美多芭能夠增加PD模型大鼠紋狀體內神經遞質含量，且β-細辛醚+1/2美多芭組與美多芭組紋狀體內神經遞質含量相當。

表1 行為學實驗結果Table 1 .Results for behavioral tests ()

表1 行為學實驗結果Table 1 .Results for behavioral tests ()

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與美多芭組比較

組別假手術組模型組美多芭組β-細辛醚組β-細辛醚+1/4美多芭組β-細辛醚+1/2美多芭組β-細辛醚+美多芭組右前肢啟動時間（t/s）5.3±1.2&15.9±4.5①6.2±1.7②8.6± 2.6②③6.6±2.2②6.5±1.8②6.8±2.0②N 10 10 10 10 10 10 10移動格子數（n/個）98.8±13.0 41.6±11.3①76.5±11.1②52.0±12.5③61.2± 13.1②③69.9±14.4②84.0±12.4②站立次數（n/次）17.8±4.2 4.6±1.6①8.6±2.7②5.3±1.8③6.6±2.4 7.4±2.2②10.2±3.0②中央格停留時間（t/s）1.9±0.7 7.7±2.0①2.5±1.0②5.2± 1.9②③5.2± 1.8②③4.5± 1.5②③1.8±0.8②轉棒停留時間（t/s）40.8±9.8 11.5±2.8①22.1±4.1②17.5 ± 4.4②③17.6±3.3②19.1±4.3②19.2±3.1②

表2 各組紋狀體中神經遞質含量比較Table 2 Comparison of the contents of neurotransmitters in the striatum of various groups ()

表2 各組紋狀體中神經遞質含量比較Table 2 Comparison of the contents of neurotransmitters in the striatum of various groups ()

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與美多芭組比較

組別假手術組模型組美多芭組β-細辛醚組β-細辛醚+1/4美多芭組β-細辛醚+1/2美多芭組β-細辛醚+美多芭組HVA[w/（ng·mg-1）]1.6±0.4 1.3±0.3 1.5±0.4 1.3±0.3 1.6±0.3 1.3±0.2 1.5±0.3 N 10 10 10 10 10 10 10 L-DOPA[w/（ng·μg-1）]36.8±5.2 30.4±2.0 119.2±28.3②39.3±2.7③68.5±16.4③98.7±9.7②88.0± 11.6②③DA[w/（ng·mg-1）]14.5±2.7 11.7±1.4①16.2±3.1②14.2±1.8 20.1±4.2②25.5±1.6②③20.1±3.1②DOPAC[w/（ng·mg-1）]1.200±0.100 0.003±0.000①1.300±0.200②0.040±0.006③0.700±0.040②0.900±0.090②0.900±0.100②5-HT[w/（ng·μg-1）]49.0±7.2 8.5±2.3①24.6±5.8 19.8±9.0 61.8±14.4②③53.0±10.1②30.8±7.2 5-HIAA[w/（ng·μg-1）]154.1±25.1 154.0±20.1 170.2±38.2 198.0±41.9 235.1±31.2 253.7±18.2 137.7±15.6

2.3 β-細辛醚聯合美多芭對6-OHDA誘導的PD模型大鼠血清中神經遞質的影響表3結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠DA含量無明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組及β-細辛醚+美多芭組大鼠DA含量明顯增高（P＜0.05）；與美多芭組比較，β-細辛醚+1/4美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組、β-細辛醚+美多芭組大鼠的DA含量差異無統計學意義（P＞0.05）。表明β-細辛醚聯合使用減少劑量的美多芭后，對血清DA含量無明顯影響。

2.4 β-細辛醚聯合美多芭對6-OHDA誘導的PD模型大鼠相關酶的影響表4結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠中腦酪氨酸羥化酶（TH）表達率明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，美多芭組和β-細辛醚+1/2美多芭組大鼠的TH表達率明顯增高（P＜0.05）。表明PD模型TH減少，美多芭和β-細辛醚+1/2美多芭均能夠升高中腦TH的含量。

表3 各組血清DA含量比較Table 3 Comparison of the serum content of DA in various groups ()

表3 各組血清DA含量比較Table 3 Comparison of the serum content of DA in various groups ()

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與美多芭組比較

組別假手術組模型組美多芭組β-細辛醚組β-細辛醚+1/4美多芭組β-細辛醚+1/2美多芭組β-細辛醚+美多芭組DA[ρ/（μg·mL-1）]129.04±41.68 152.61±44.73 296.06±43.22①169.70±42.03②209.83±68.15 289.90±55.45①273.43±51.40①N 10 10 10 10 10 10 10

與假手術組比較，模型組血清中DDC含量無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，美多芭組、β-細辛醚、β-細辛醚+1/4美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚+美多芭組的大鼠的血清中DDC的含量明顯下降（P＜0.05）。表明美多芭、β-細辛醚、β-細辛醚+1/4美多芭、β-細辛醚+1/2美多芭和β-細辛醚+美多芭均能夠抑制血清DDC含量。

各組中腦內DDC含量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。表明PD大鼠中腦DDC無明顯變化，美多芭、β-細辛醚單獨用藥或聯合用藥治療亦對中腦DDC無明顯影響。

2.5 β-細辛醚聯合美多芭對6-OHDA誘導的PD模型大鼠肝腎功能的影響表5結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠的ALT、AST、Cr、BUN和TBIL的含量無明顯差異（P＞0.05）。與模型組比較，美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組和β-細辛醚+美多芭組大鼠的ALT和BUN含量明顯增加（P＜0.05），美多芭組、β-細辛醚+1/4美多芭組、β-細辛醚+1/2美多芭組、β-細辛醚+美多芭組大鼠CR含量明顯增加（P＜0.05），各治療組AST、TBIL無明顯差異（P＞0.05）。表明PD模型肝腎功能無損害，應用美多芭后，肝腎功能指標明顯升高。

表4 各組中腦TH表達率，血清、中腦內DDC含量比較Table 4 Comparison of the expression rate of DDC in the mesocerebrum and the content of DDC in the serum and mesocerebrum of various groups ()

表4 各組中腦TH表達率，血清、中腦內DDC含量比較Table 4 Comparison of the expression rate of DDC in the mesocerebrum and the content of DDC in the serum and mesocerebrum of various groups ()

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組美多芭組β-細辛醚組β-細辛醚+1/4美多芭組β-細辛醚+1/2美多芭組β-細辛醚+美多芭組DDC中腦[w/（ng·g-1）]5.1±1.5 4.0±1.1 4.1±2.0 5.5±2.7 4.3±1.7 3.4±2.0 3.4±1.6 N 10 10 10 10 10 10 10中腦TH表達率（p/%）10.4±1.7 7.5±1.9①9.0±0.8②8.9±1.6 8.5±2.6 10.5±2.6②7.0±1.5血清[ρ/（ng·mL-1）]13.9±2.5 12.7±2.5 7.5±1.1②9.4±1.0②9.7±3.0②9.5±1.1②8.1±0.9②

2.6 β-細辛醚聯合美多芭對6-OHDA誘導的PD模型大鼠肝腎病理變化的影響圖1結果顯示：假手術組、模型組和β-細辛醚組大鼠的肝組織結構正常，肝細胞排列整齊，邊界清晰，形態完整，未見脂肪空泡，匯管區未見炎性細胞浸潤。腎皮質和髓質結構清晰，腎小球未見增生或萎縮、毛細血管袢未見壞死，腎小球毛細血管未見擴張充血、管壁未見增厚，腎間質未見炎細胞浸潤。美多芭組的大鼠的肝組織匯管區較多炎細胞浸潤。腎間質小片狀炎性細胞浸潤。聯合用藥組大鼠的肝組織結構正常，肝細胞排列整齊，邊界清晰，形態完整，未見脂肪空泡，匯管區可見不同程度炎細胞浸潤，且以β-細辛醚+1/4美多芭組大鼠的匯管區炎性細胞最少。β-細辛醚+美多芭組大鼠的腎間質內小灶狀炎性細胞浸潤，β-細辛醚+1/2美多芭組大鼠的腎間質內炎細胞逐漸減少，β-細辛醚+1/4美多芭組大鼠的腎間質內炎性細胞最少。

表5 各組肝腎功能比較Table 5 Comparison of the hepatic-renal function in various groups ()

表5 各組肝腎功能比較Table 5 Comparison of the hepatic-renal function in various groups ()

①P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組美多芭組β-細辛醚組β-細辛醚+1/4美多芭組β-細辛醚+1/2美多芭組β-細辛醚+美多芭組TBIL[c/（μmol·L-1）]4.2±1.0 4.0±1.3 3.7±1.9 4.5±1.8 4.8±1.5 3.9±1.2 4.0±1.6 N 10 10 10 10 10 10 10 ALT[J/（U·L-1）]11.3±3.0 10.6±2.5 17.4±4.3①10.8±3.1 12.3±1.5 14.8±2.2①18.5±2.2①AST[J/（U·L-1）]13.9±3.1 14.7±3.5 13.4±3.8 14.2±4.2 12.7±4.5 14.4±4.5 15.6±4.3 Cr[c/（μmol·L-1）]17.5±3.3 22.0±6.6 43.5±10.2①23.6±4.8 29.1±5.8①36.6±7.3①42.7±6.3①BUN[c/（mmol·L-1）]61.7±12.7 65.0±16.1 100.0±30.2①70.0±5.6 79.6±21.5 93.5±18.1①100.4±20.1①

圖1 各組肝腎組織病理變化比較（n=3，HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathological changes of liver and kidney tissues in vaious groups（n=3，by HE staining，×200）

3 討論

PD屬于中醫學的顫證，亦稱“顫振”、“振掉”、“震顫”等，是神經系統退行性疾病。病理特征為多巴胺能神經元減少及神經元內路易小體的形成。臨床癥狀主要表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵直及姿勢步態異常等。美多芭是臨床上治療PD的常用藥物，能夠有效改善PD的臨床癥狀，但隨著應用時間的延長，多會出現療效減低和不隨意運動等副作用。本研究觀察β-細辛醚聯合美多芭對6-OHDA誘導的PD模型大鼠的行為學、DA等神經遞質、促進DA合成的相關酶及肝腎功能和組織病理學的影響，結果顯示β-細辛醚聯合1/2或1/4劑量美多芭，療效與單獨使用美多芭相當，可減輕血清肝腎功能和肝腎病理的損害，從而達到減少美多芭的使用劑量的目的，這樣可以延長美多芭的應用時間，減輕美多芭引起的肝腎功能損害。

本研究觀察到β-細辛醚聯合小劑量美多芭能夠改善6-OHDA誘導的PD模型大鼠的自主運動功能、平衡能力與協調性及感覺運動整合功能，減輕肝腎功能損害。這與我們的前期研究結果一致，β-細辛醚能夠明顯改善PD模型大鼠的自主活動次數、滾軸運動能力，使PD模型大鼠平衡能力明顯增高[12]；聯合L-DOPA能夠改善PD模型大鼠的行為學，并能夠減少肝腎功能損害[9]。說明β-細辛醚聯合小劑量美多芭的療效與單獨使用常規劑量的美多芭療效相當。

DA是腦內的一種神經遞質，PD患者的黑質紋狀體中DA的含量不足導致PD的運動障礙。L-DOPA是合成DA的中間產物，是DA的前體，在L-DOPA轉化為DA的限速酶DDC的作用下生成DA。L-DOPA可以通過血腦屏障，而DA本身則不能，因此L-DOPA被用作治療PD的藥物來增加DA的水平。L-DOPA在腦外以及大腦組織中發生快速脫羧反應生成DA，使得大多數L-DOPA不能到達腦內，而外周產生的DA常會引起不良反應。因此，抑制腦外組織中L-DOPA的脫羧反應是十分必要的。L-DOPA與外周脫羧酶抑制劑芐絲肼同時給藥即可達到這一目的。美多芭是L-DOPA與芐絲肼按4∶1制成的復方制劑，在臨床試驗和治療應用中已證明這一比例具有最佳療效，與單獨給予大劑量L-DOPA的效果相當。本實驗結果觀察到：聯合用藥可以增加紋狀體內L-DOPA、DA、DOPAC和5-HT的含量，增加血清內DA的含量，同時抑制血清中的DDC。β-細辛醚可能通過抑制血清DDC，從而減少L-DOPA在腦外脫羧轉化為DA，這能夠減輕L-DOPA在腦外轉化為DA所產生的副作用，并提高腦內DA的含量。

TH是酪氨酸轉化為L-DOPA的限速酶，本實驗結果觀察到：美多芭組和β-細辛醚+1/2美多芭組的大鼠的TH的表達率明顯增高。這一結果表明，聯合用藥能夠增加腦內L-DOPA的生成量，有利于DA的生成。

本研究觀察到應用美多芭后，肝腎功能血液及病理變化指標比沒有應用美多芭組有明顯升高，說明美多芭對肝腎功能有影響。故減少美多芭的使用劑量，可以減輕美多芭引起的肝腎功能損害。

綜上所述，β-細辛醚聯合低劑量美多芭，療效與單獨使用美多芭相當，且可減輕對肝腎功能和肝腎病理的損害，從而達到減少美多芭的使用劑量的目的，這樣可以延長美多芭的應用時間，減輕美多芭引起的肝腎功能損害。其原因可能是通過提高腦組織內TH含量，抑制血清內DDC的含量來增加腦組織內單胺類神經遞質的含量。本研究為臨床治療PD提供了新的思路。