調胃承氣湯對腸源性膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能的保護作用

張延林， 鄭剛， 熊明， 王昊， 易紹龍， 努爾阿依木·莫合塔，依不拉音·庫爾班， 黃虎， 趙鋒利

（1.新疆喀什地區第一人民醫院，新疆喀什 844000；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

膿毒癥是宿主對感染的反應失調而引起的致命性的多器官功能障礙[1]。多器官功能障礙綜合征（MODS）表現為全身多種器官的正常功能受到嚴重影響，其中胃腸道一般為最早出現損傷且損傷程度最為嚴重的靶器官[2]。雖然胃腸道是人體最大的細菌和內毒素的貯存場所，在正常生理狀態下它們對機體幾乎無損害，但在病理情況下，細菌和內毒素通過受損的腸黏膜向其他器官遷移而發生腸源性膿毒癥（GOS）[3]。

據臨床調查顯示，全世界范圍內每年約有1百萬例膿毒癥患者，其死亡率高達25%，膿毒癥已成為威脅人類生命健康的重要疾病[4]。目前除一般治療措施、抗菌治療、控制感染源等治療方法外，還可運用中醫藥進行治療[5]。有研究表明調胃承氣湯可減輕重癥胃腸功能障礙患者的病情危重程度[6]。調胃承氣湯為《傷寒論》的緩下方，由大黃、炙甘草和芒硝3味藥物組成，具有解熱、解毒、調節胃腸道功能等藥理作用[7，8]。本研究擬探討調胃承氣湯對腸源性膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能的保護作用機制，以期為臨床用藥提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物40只SPF級雄性SD大鼠，體質量280～320 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002；實驗動物質量合格證號：44007200047550。動物實驗環境：廣東省中醫藥工程技術研究院SPF級動物實驗室。設施使用許可證號：SYXK（粵）2010-0059。

1.2受試藥物調胃承氣湯（由大黃、芒硝、炙甘草3味中藥組成），大黃（批號：130908261）、芒硝（批號：130707541）、炙甘草（批號：130713191）均購自康美藥業股份有限公司。煎煮方法：以水2 L，煎煮大黃、炙甘草至1 L，去滓，納芒硝，再用微火煮沸1～2次[9]。由實驗動物與人體等效劑量關系計算得給藥劑量：高劑量為9.45 g/kg，低劑量為4.73 g/kg[10]。

1.3實驗試劑大鼠白細胞介素6（IL-6）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（批號：385r1229）、大鼠內 毒 素/脂 多 糖（LPS）ELISA試 劑 盒（批號：261180115）、腸型脂肪酸結合蛋白（iFABP）ELISA試劑盒（批號：387180115），均購自天津安諾瑞康生物技術有限公司。Occludin購自美國Proteintech公司，批號：66378-1-Ig。注射用烏司他丁（Ulinastatin）購自廣東天普生化醫藥股份有限公司，產品批號：031609203。

1.4實驗儀器Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司）；5450型小型高速離心機（德國Eppendorf公司）；Leica TP 1020型全自動脫水機、Leica RM2235輪式切片機（德國Leica公司）；YD62型石蠟包埋機、YD-AB型攤烘烤片機（浙江金華益迪公司）；DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風干燥箱（上海精密實驗設備廠）；Shandon Gemini染色機（德國Thermo公司）；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統（日本Olympus公司）。

1.5動物模型復制采用盲腸結扎穿刺法（CLP）復制腸源性膿毒癥大鼠模型[11]。實驗前大鼠禁食不禁水12 h，使用100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。備皮后沿腹中線開口約2 cm，小心取出盲腸置于消毒紗布上，將糞便推至盲腸尾端。用1號醫用真絲編織線于盲腸中段進行結扎，往盲腸尾端注射1 mL生理鹽水稀釋糞便，用10 mL注射器針頭穿孔3次，使用棉簽輕輕擠壓盲腸使糞便能順利流出，然后將盲腸小心放回腹腔。逐層縫合切口，腹腔注入5 mL 37℃生理鹽水使大鼠生理復蘇。歸籠飼養，自由飲用水和飼料。造模成功標準：造模后大鼠出現豎毛、乏力少動、眼角分泌黏液、顫抖、體溫異常等生理異常，炎癥反應失調[12]。

1.6分組與給藥將大鼠隨機分為5組，即假手術組、模型組、烏司他丁組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組8只。于造模后2、10、24 h按照10 mL/kg分別給予大鼠灌胃給藥，并在最后1次給藥后0.5 h結束實驗。中藥高、低劑量組大鼠分別給予調胃承氣湯（劑量分別為9.45、4.73 g/kg）灌胃，假手術組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃。烏司他丁組按3 mL/kg給予大鼠腹腔注射烏司他丁（劑量為30 000 U/kg）。

1.7觀察指標與方法

1.7.1 標本采集 實驗結束時，用水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，取血清于-80℃凍存，取小腸組織10 cm固定于體積分數10%甲醛中，以備病理組織學與免疫組化法檢測。

1.7.2 血清中各相關指標檢測 嚴格按照ELISA試劑盒測試方法檢測血清中IL-6、LPS和iFABP含量。將捕獲抗體包被至微孔內壁表層，添加標準品，添加樣品及生物素標記抗體，添加辣根過氧化氫酶標記的抗體，加底物顯色終止實驗。酶標儀檢測吸光度（OD）值。

1.7.3 小腸黏膜病理學檢查 將小腸組織固定于體積分數10%甲醛1～2 d后，切成厚度為2 mm的橫截組織塊，用水沖洗后在自動組織處理機中進行脫水、透明和浸蠟。運用組織包埋機進行包埋，冷卻后切片4 μm，脫蠟。經二甲苯脫蠟后用染色機進行蘇木素—伊紅（HE）染色。封片，鏡下觀察。

1.7.4 occludin蛋白的免疫組化檢查 同小腸黏膜病理學檢查法制作切片，脫蠟，水化后用PBS沖洗3次，阻斷；PBS沖洗3次，抗原修復，加入血清封閉，加入Ⅰ抗，PBS沖洗3次；加入Ⅱ抗，PBS沖洗3次，滴加SP，DAB顯色5～10 min，自來水沖洗以終止反應，復染；常規脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察。

1.8統計方法采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差()表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進一步兩兩比較組間均數，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠一般表現CLP造模手術后，除假手術組外，給藥前其他各組大鼠均出現精神萎靡、豎毛、眼角分泌黏液等膿毒癥模型癥狀。給藥后烏司他丁組、中藥高劑量組與中藥低劑量組相應癥狀減輕。

2.2血清中各相關指標檢測結果表1結果顯示：與假手術組比較，模型組IL-6、LPS、iFABP水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，烏司他丁組，中藥高、低劑量組IL-6、LPS、iFABP水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3腸源性膿毒癥大鼠小腸黏膜損傷程度光鏡下觀察各組大鼠小腸HE染色病理切片，評價小腸組織損傷程度[13]。圖1結果顯示：假手組大鼠光鏡下小腸黏膜結構基本正常，絨毛結構完整，無炎性組織浸潤；模型組可見絨毛壞死，黏膜間隙擴大，固有層萎縮，炎性組織浸潤嚴重；烏司他丁組絨毛結構部分被破壞，固有層完整，黏膜間隙較小，炎性組織浸潤相對減少；中藥高、低劑量組絨毛結構相對完整，黏膜間隙部分擴大，炎性組織浸潤相對減少。

2.4小腸組織緊密連接蛋白occludin的表達圖2與表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠小腸組織occludin蛋白表達顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高、低劑量組與烏司他丁組大鼠小腸組織occludin蛋白表達顯著上升（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清IL-6、LPS、iFABP水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of IL-6，LPS，and iFABP in various groups ()

表1 各組大鼠血清IL-6、LPS、iFABP水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of IL-6，LPS，and iFABP in various groups ()

①P＜0.01，與假手術組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

組別假手術組模型組烏司他丁組中藥高劑量組中藥低劑量組iFABP[ρ/（pg·mL-1）]611.36±140.59 1447.43±220.49①927.01±194.10③863.14±164.28③940.63±206.32③N8 8 8 8 8 IL-6[ρ/（pg·mL-1）]76.59±12.99 115.34±13.91①90.17±18.79③96.65±19.75②85.05±8.04③LPS[J/（EU·mL-1）]5.25±0.64 8.82±0.74①6.10±0.41③7.51±0.86③5.78±0.97③

圖1 各組大鼠小腸組織光鏡下HE染色病理結果（×100）Figure 1 Comparison of the pathological features of small intestine tissues in various groups by HE staining under light microscope（×100）

圖2 各組大鼠腸黏膜occludin蛋白表達比較（免疫組化，×400）Figure 2 Comparison of the expression of occludin in intestinal mucosa of various groups（by immunohistochemistry， ×100）

表2 各組大鼠腸組織緊密連接蛋白occludin表達量比較Table 2 Comparison of the expression quantity of tight junction protein occludin in small intestine of various groups ()

表2 各組大鼠腸組織緊密連接蛋白occludin表達量比較Table 2 Comparison of the expression quantity of tight junction protein occludin in small intestine of various groups ()

①P＜0.01，與假手術組比較；②P＜0.01，與模型組比較

occludin蛋白（p/%）46.65±1.95 22.62±2.89①42.69±2.57②41.48±3.02②44.14±2.62②組別假手術組模型組烏司他丁組中藥高劑量組中藥低劑量組N8 8 8 8 8

3 討論

腸源性膿毒癥通常是由于一定原因造成腸黏膜屏障的防御機制被破壞，細菌和內毒素通過受損部位進入血液循環導致全身炎癥反應綜合征（SIRS）。隨后，機體免疫反應失調造成各器官功能開始惡化，最終形成多器官功能障礙綜合征（MODS），嚴重時會發生感染性休克或死亡[14]。其發病機制包括腸道微生態紊亂、腸黏膜屏障受損和機體免疫功能障礙等[15]。因此，對受損腸黏膜屏障功能的保護和改善是治療腸源性膿毒癥的有效途徑之一。

正常生理狀態下，LPS與腸型脂肪酸結合蛋白（iFABP）外周血含量微乎其微，檢測血中LPS和iFABP含量即可反映腸黏膜屏障功能的受損程度[16，17]。IL-6能打破抗炎平衡狀態并放大炎癥反應進程和毒性作用，造成腸黏膜等組織細胞損傷，血中IL-6含量在判斷膿毒癥嚴重程度時具有標志性的作用[18，19]。在病理狀態下，緊密連接蛋白產生收縮，細胞間隙顯著擴大，致使細菌、內毒素等有害物質擴散，腸黏膜屏障功能受到嚴重破壞[20]。本實驗結果表明調胃承氣湯能顯著改善膿毒癥大鼠模型血中LPS、iFABP與IL-6含量的異常，具有修復緊密連接的作用。

臨床中燒傷、手術或有嚴重創傷的患者由于容易受到細菌等有害物質感染，引起機體產生炎癥級聯反應而發展成為膿毒癥[21]。胃腸道通常最先受到炎性因子攻擊，從而給腸黏膜細胞帶來嚴重的殺傷性，破壞緊密鏈接蛋白的黏膜屏障作用，使其屏障功能降低。大量細菌與LPS通過受損腸黏膜進入血液循環，如此往復循環造成嚴重免疫失調，最終導致膿毒癥休克甚至死亡等嚴重后果[2]。本研究結果提示，調胃承氣湯能上調緊密連接蛋白occludin的表達，修復腸組織緊密連接蛋白，有效地改善與保護腸黏膜組織結構，抑制細菌和LPS的進一步擴散，從中間環節阻止了炎癥反應的放大，進而減少了IL-6等炎性因子對各器官功能的損傷。因此，調胃承氣湯對腸源性膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能具有一定的保護作用，其機制可能與上調occludin蛋白的表達有關。